Estructuras bacterianas rectangulares previamente no caracterizadas en la boca del delfín

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 2098 (2023) Citar este artículo

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Queda mucho por explorar con respecto a la diversidad de microbios no cultivados asociados al huésped. Aquí, describimos estructuras bacterianas rectangulares (RBS) en la boca de los delfines mulares. La tinción del ADN reveló múltiples bandas emparejadas dentro de las RBS, lo que sugiere la presencia de células que se dividen a lo largo del eje longitudinal. La microscopía electrónica de transmisión criogénica y la tomografía mostraron segmentos paralelos unidos a membranas que probablemente sean células, encapsulados por una cubierta superficial periódica similar a una capa S. Los RBS mostraban apéndices inusuales parecidos a pilus con haces de hilos extendidos en las puntas. Presentamos múltiples líneas de evidencia, incluida la secuenciación del ADN genómico de RBS micromanipuladas, la secuenciación del gen 16S rRNA y la hibridación fluorescente in situ, lo que sugiere que las RBS son bacterianas y distintas de los géneros Simonsiella y Conchiformibius (familia Neisseriaceae), con los que comparten una morfología similar. y patrones de división. Nuestros hallazgos resaltan la diversidad de nuevas formas y estilos de vida microbianos que esperan caracterización utilizando herramientas complementarias a la genómica como la microscopía.

Las primeras descripciones del mundo microbiano se centraron en los patrones de morfología y motilidad de los “animálculos”1. En los siglos transcurridos desde el revolucionario descubrimiento de van Leeuwenhoek, se ha descrito una gran diversidad de formas microbianas, que van desde bacterias con forma de estrella del género Stella2,3 hasta los cuerpos fructíferos multicelulares característicos del orden Myxobacterales4,5. La morfología es una característica biológicamente importante, a menudo altamente conservada y moldeada con el tiempo por presiones selectivas resultantes del estilo de vida y el contexto ambiental de un organismo6. De hecho, la morfología celular juega un papel importante en la motilidad, la adquisición de nutrientes, la división celular y las interacciones con otras células, incluidas las simbiosis con los huéspedes, todos los cuales son fuertes determinantes de la supervivencia7. Como tal, los estudios morfológicos y estructurales ofrecen una ruta atractiva para obtener información sobre las formas de vida microbiana y los mecanismos mediante los cuales las especies funcionan y afectan sus entornos. Además, caracterizar las estructuras y funciones de la diversa gama de microbios en ramas inexploradas del árbol de la vida brinda la oportunidad de ampliar nuestra comprensión de la evolución y puede resultar en innumerables aplicaciones en biotecnología y medicina, ejemplificadas por el desarrollo de la optogenética8 y CRISPR- edición de genes basada9.

La genómica sirve como una poderosa lente a través de la cual describir el mundo microbiano. En los últimos años, los análisis metagenómicos y genómicos unicelulares han aumentado sustancialmente el número de linajes microbianos conocidos a nivel de filo en un factor de casi cuatro en el dominio bacteriano10,11,12,13. La secuenciación de los genomas de organismos recién descubiertos ha llevado al descubrimiento de nuevos sistemas funcionales, tipos de variantes de proteínas y estilos de vida11,14,15,16,17, lo que ilustra la correlación entre la diversidad filogenética y el potencial funcional18. Sin embargo, la aplicabilidad de tales enfoques se limita principalmente a proteínas y sistemas reguladores homólogos a los de organismos bien caracterizados; la predicción de fenotipos y funciones verdaderamente novedosos y/o cuya base genética se desconoce generalmente requiere conocimientos complementarios. Dada la reticencia de la mayoría de las especies microbianas de la Tierra al cultivo en laboratorio (en 2016, el 72% de los linajes aproximadamente a nivel de filo carecían de cualquier representante cultivado)19, los métodos que no requieren aislados cultivados, como la microscopía, ofrecen una ruta atractiva y complementaria para para estudiar nuevas propiedades morfológicas y funcionales de linajes no cultivados. Por ejemplo, los avances recientes en microscopía electrónica criogénica (cryoEM) y tomografía (cryoET) han permitido obtener imágenes tridimensionales (3D) de células bacterianas intactas con una resolución de unos pocos nanómetros20, lo que ha llevado a importantes avances en el descubrimiento y caracterización de nuevas bacterias microbianas. estructuras21,22. En la actualidad, nuestro conocimiento de la biología celular se ha limitado en gran medida a la observación y experimentación con bacterias que pueden cultivarse y, por tanto, existe un grave sesgo en nuestra comprensión hacia los organismos que favorecen el crecimiento en condiciones de laboratorio. El uso de microscopía y técnicas no basadas en secuenciación para estudiar "la mayoría inculta" será esencial para caracterizar la diversidad completa de estilos de vida bacterianos que han evolucionado, en particular los esfuerzos por caracterizar bacterias en entornos relativamente no estudiados, como la cavidad bucal de los animales. delfines (Tursiops truncatus), que albergan una rica colección de microbios novedosos y potencial funcional16,23.

A pesar de la diversidad de formas de las células microbianas, las estructuras rectangulares son una rareza, con una base genética poco conocida. Estas estructuras son de dos tipos: células individuales que son rectangulares y agregados de células que forman rectángulos. Hasta donde sabemos, el descubrimiento de células rectangulares no eucariotas se ha restringido hasta ahora a la familia Halobacteriaceae, que consiste en Archaea halófilas. Las células rectangulares conocidas de esta familia incluyen Haloquadratum walsbyi24, Haloarcula quadrata25 y miembros del género pleomórfico Natronrubrum26. Recientemente se ha observado fisión basada en FtsZ en el nematodo simbionte con forma de cubo Candidatus Thiosymbion cuboideus27 y se han descubierto células rectangulares adicionales que se cree que son bacterianas o arqueales en ambientes de alta salinidad, pero no se han identificado taxonómicamente28. Entre los microorganismos eucariotas, las diatomeas pueden tener una apariencia rectangular cuando se visualizan en dos dimensiones, aunque estas células son prismas cilíndricos en lugar de rectangulares29. Una variedad de bacterias forman grupos de células rectangulares, como láminas de bacterias cocoides (p. ej., Thiopedia rosea y el género Merismopedia30), estructuras cúbicas de bacterias cocoides (p. ej., los géneros Sarcina y Eucapsis30) y tricomas rectangulares formados por bacterias en forma de disco. (p. ej., Oscillatoria limosa y otras cianobacterias30).

También son raras en el mundo microbiano las células que se apartan del patrón típico de división celular a lo largo de un eje transversal. Dos ejemplos espectaculares son Candidatus Thiosymbion oneisti y Candidatus Thiosymbion hypermnestrae31,32,33, que se han encontrado exclusivamente en la superficie de nematodos marinos. Se cree que este patrón de división preserva el apego al huésped31,32. De manera similar, los miembros de la familia Neisseriaceae, los géneros Alysiella, Simonsiella y Conchiformibius se dividen longitudinalmente, lo que se cree que ayuda con la adherencia a las células epiteliales humanas en la cavidad bucal34. Estos taxones son además sorprendentes porque pueden considerarse bacterias multicelulares. Ejemplos adicionales de bacterias que se someten a división longitudinal incluyen Spiroplasma poulsonii35 y el género Candidatus Kentron, un clado de simbiontes hospedados por el ciliado marino Kentrophoros36,37. Este conocimiento de los métodos reproductivos de diversas bacterias es esencial para lograr una comprensión integral de la biología celular.

Aquí, descubrimos estructuras bacterianas rectangulares (RBS) inusuales en muestras orales de delfines y caracterizamos sus dimensiones celulares y patrones de ADN mediante microscopía de contraste de fase y fluorescencia. Las bandas regulares de ADN sugieren que las unidades son láminas de células individuales, cada una de las cuales está encapsulada por una membrana interna y externa, mientras que los experimentos de hibridación fluorescente in situ (FISH) y la secuenciación metagenómica sugieren fuertemente que son bacterias y miembros potenciales de la clase. Betaproteobacterias. Utilizando microscopía electrónica de transmisión criogénica (cryoTEM) y crioET, caracterizamos la estructura de la envoltura de las RBS y descubrimos características de la superficie no observadas previamente, como haces heterogéneos de apéndices que sobresalen de los extremos de las RBS y se extienden en las puntas. Estos hallazgos resaltan el poder de la microscopía de alta resolución para explorar la naturaleza de los microbios no cultivados.

Se recolectaron muestras de hisopos orales de la boca de ocho delfines mulares (Tursiops truncatus) bajo el ámbito del Programa de Mamíferos Marinos (MMP) de la Marina de los EE. UU. en la Bahía de San Diego, California, EE. UU., durante tres intervalos distintos en 2012, 2018 y 2022 ( Métodos). Los RBS fueron fácilmente evidentes en las imágenes de microscopía de contraste de fase (Fig. 1a-e). Los RBS parecían prismas rectangulares; no eran cilíndricos (Película complementaria 1). Exhibieron características Gram negativas después de la tinción de Gram (Fig. 1f). Los intentos de teñir la membrana con FM4-64 no tuvieron éxito, ya que el tinte FM4-64 no tiñó ninguna parte de las RBS. Los RBS contenían múltiples bandas paralelas de fluorescencia con tinción DAPI (Fig. 1b-e). En algunas RBS, los pares de bandas de ADN vecinas aparecían en forma de "H" (Fig. 1g, flecha blanca), lo que sugiere dos células en forma de bastón en proceso de división a lo largo de un eje longitudinal con las bandas de ADN sometidas a segregación27. Las RBS se agruparon en dos morfotipos según las dimensiones de las unidades rectangulares (Fig. 1h). Utilizando materiales de una sola muestra de hisopo oral de delfines, cuantificamos la longitud y el ancho de 23 RBS. El morfotipo A exhibió una longitud mediana de 3,95 ± 2,89 µm de desviación absoluta mediana (MAD) y un ancho mediano de 5,08 ± 0,10 µm MAD (n = 15 RBS). El morfotipo B tenía una longitud mediana de 3,08 ± 0,93 µm MAD y una anchura mediana de 2,21 ± 0,56 µm MAD (n = 8 RBS). Las dimensiones tanto para el largo como para el ancho fueron significativamente diferentes entre los dos morfotipos (para el largo, p = 0,02; para el ancho, p = 10-10; prueba t de Welch bilateral). Los diferentes morfotipos pueden representar diferentes tipos de células o grupos taxonómicos (por ejemplo, cepas o especies), células en diferentes etapas de desarrollo o células con forma alterada en respuesta a las condiciones ambientales.

a Imágenes de contraste de fase de RBS (la flecha indica un ejemplo) en la superficie de células epiteliales orales de delfines. Consulte también la película complementaria 1. b, c Algunas RBS exhibieron bandas largas de fluorescencia DAPI. La imagen de contraste de fase se muestra en (b), con una superposición de fluorescencia en cian en (c). d, e Otras RBS exhibieron bandas DAPI más cortas. La imagen de contraste de fase se muestra en (d), con una superposición de fluorescencia en cian en (e). Los puntos oscuros (flechas) se organizaron en líneas perpendiculares a las bandas teñidas con DAPI. Las bandas teñidas con DAPI parecían estar organizadas en pares. f Las RBS teñidas con Gram muestran características gramnegativas. Recuadro: Bacillus subtilis (Bs, grampositivo) y Escherichia coli (Ec, gramnegativo) teñidos con Gram. g Los pares de bandas de ADN vecinas en una RBS forman formas tipo “H” (flecha), probablemente porque las bandas de ADN son nucleoides segregados en una célula que se somete a división longitudinal. h Los dos morfotipos de RBS tienen distribuciones distintas de largo y ancho. El ancho y la longitud medianos de 15 RBS-A midieron 3,95 ± 2,89 µm MAD y 5,08 ± 0,10 µm MAD, respectivamente, y para 8 RBS-B midieron 3,08 ± 0,93 µm MAD y 2,21 ± 0,56 µm MAD, respectivamente. Los centros de las cruces naranja y azul representan las medias de RBS-A y RBS-B, respectivamente, mientras que las longitudes de los brazos representan ±1 desviación estándar.

Evaluamos la prevalencia de RBS de cada morfotipo en un conjunto de 73 muestras de hisopos orales recolectadas de ocho delfines (Datos complementarios 1) utilizando un flujo de trabajo de microscopía de contraste de fase automatizado de alto rendimiento que recopiló datos de imágenes para 226 campos de visión por muestra38. Se detectaron RBS del morfotipo A, en adelante denominadas RBS-A, en 39/73 muestras de 7/8 delfines (tenga en cuenta que el número de muestras por delfín no es constante y que se tomaron muestras de diferentes ubicaciones orales en diferentes años). Se detectaron RBS del morfotipo B, en adelante denominados RBS-B, en 42/73 muestras de 6/8 delfines. De 25 de estas 73 muestras que se recolectaron de distintos sitios orales, se detectaron RBS en muestras palatinas (RBS-A = 5/5; RBS-B = 4/5) y gingivales (RBS-A = 12/15; RBS- B = 14/15), pero con menor frecuencia en muestras bucales (RBS-A = 0/5; RBS-B = 2/5). Por lo tanto, inferimos que las RBS son colonizadores estables en la cavidad bucal de los delfines y tienen ubicaciones de colonización preferidas.

En este estudio, nos centramos en RBS-A, ya que este morfotipo tenía una mayor abundancia en las muestras orales de delfines y es morfológicamente más distinto de otros microbios conocidos.

Dada la intrigante morfología de las RBS, a continuación buscamos determinar su afiliación taxonómica. Las RBS se parecen morfológicamente a miembros de los géneros Simonsiella y Conchiformibius (familia Neisseriaceae), que son comensales orales con forma de bastón en los mamíferos39. En un nuevo análisis de la biblioteca de clones de Sanger y 454 datos de pirosecuenciación de un estudio previo de amplicones del gen 16S rRNA de muestras de hisopos gingivales de 38 delfines de la misma población23, no se detectó S. muelleri (la única especie del género Simonsiella) ni el género Conchiformibius. Se detectaron amplicones en cualquiera de estas muestras, aunque se detectaron otros miembros de la familia Neisseriaceae en estas muestras orales de delfines. Se detectó un supuesto tipo de secuencia de S. muelleri en la biblioteca Sanger a partir de la boca y el fluido gástrico de un león marino examinado en el mismo estudio de amplicones23 (número de acceso del NCBI JQ205404.1); esta secuencia parcial del gen 16S rRNA tiene una identidad del 94,6 % y una cobertura de consulta del 99 % con la secuencia parcial del gen 16S rRNA de S. muelleri ATCC 29453 (número de acceso del NCBI NR_025144.1). El primer estudio detectó otros cinco tipos de secuencias de la familia Neisseriaceae en la biblioteca Sanger de leones marinos (boca y estómago), agua y especies de peces alimentadas a mamíferos marinos23. Mientras tanto, se recuperaron cuatro tipos de secuencias de la familia Neisseriaceae en el estudio de pirosecuenciación 454, de delfines (estómago, sistema respiratorio), leones marinos (boca, estómago), peces y agua de mar. Estas identificaciones positivas indican que el ADN de S. muelleri y la familia Neisseriaceae se pudo extraer con éxito en el estudio anterior, aunque no se detectaron en ninguna muestra oral de delfines23.

Luego realizamos la secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA en 54 muestras orales de delfines (Métodos), lo que resultó en la detección de 1.116.394 variantes de secuencia amplificadas (ASV) a partir de 5.339.751 lecturas de secuencia. De estas 54 muestras, 48 ​​se examinaron de manera de alto rendimiento para detectar RBS mediante microscopía de contraste de fase (Métodos). Se detectaron RBS-A y RBS-B cada uno en 22/48 muestras (45,8%), pero no en las mismas 22 muestras. Se detectó uno u otro morfotipo en 30/48 muestras (62,5%). Las curvas de rarefacción sugirieron que la profundidad de la secuenciación era suficiente para que los resultados estuvieran cerca de la saturación de la riqueza de ASV (Fig. 2a). No se detectaron amplicones de la familia Neisseriaceae en estas muestras (Fig. 2b), a pesar de nuestra capacidad para recuperar secuencias de S. muelleri de muestras de hisopos orales previamente negativas después de agregar deliberadamente alícuotas de estas muestras con S. muelleri. Los ASV comunes a las muestras positivas de RBS-A y RSB-B se pueden ver en las Tablas complementarias 1 y 2, respectivamente.

Las muestras orales de delfines (n = 54) se sometieron a una secuenciación profunda del amplicón del gen 16S rRNA. a Curvas de rarefacción para las 54 muestras orales de delfines secuenciadas. b Para cada familia de clase Betaproteobacteria detectada en las 54 muestras orales de delfines, se representa gráficamente la abundancia relativa de los ASV miembros. Tenga en cuenta que el género Simonsiella es miembro de la clase Betaproteobacteria, familia Neisseriaceae; No se detectaron ASV afiliados a esta familia. El examen visual mediante microscopía de contraste de fase (ver Métodos) reveló RBS de morfotipo A o B en 39 de 73 muestras analizadas (tenga en cuenta que en total 73 muestras se examinaron visualmente para detectar RBS; 54 se usaron para la secuenciación de amplicones, mientras que el resto se usó para otros experimentos) (Datos complementarios 1). c La secuenciación de un cultivo puro de S. muelleri y una muestra oral de delfín (conteniendo RBS-As confirmado) con S. muelleri enriquecido dio como resultado la detección de un ASV de la familia Neisseriaceae. El mismo ASV se detectó con una abundancia relativa de <0,1 % en esa misma muestra oral de delfines en su estado inalterado (sin adición de S. muelleri) cuando se preparó y secuenció en paralelo con las muestras positivas de S. muelleri; El ASV no se detectó en ninguna muestra oral de delfines antes de la introducción de S. muelleri en el ambiente del laboratorio.

El origen marino y la naturaleza rectangular de las RBS también dieron lugar a la especulación de que podrían ser diatomeas marinas (por ejemplo, Skeletonema costatum), ya que las diatomeas marinas cilíndricas pueden parecer rectangulares en dos dimensiones. Por lo tanto, a continuación evaluamos un posible origen eucariota de las RBS. Realizamos FISH utilizando sondas eucariotas (Euk-1209) y bacterianas (Eub-338) marcadas, la última de las cuales se hibrida tanto con bacterias como con arqueas. Como controles, cultivamos e incluimos S. costatum y la bacteria Escherichia coli. La sonda Eub-338 se hibridó tanto con E. coli como con las RBS, mientras que la sonda eucariota Euk-1209 se hibridó solo con células de S. costatum (Figura 1 complementaria), lo que indica que las RBS no son eucariotas y, por lo tanto, no son diatomeas.

Sin más hipótesis a priori sobre la naturaleza específica de las RBS, aplicamos una variedad de enfoques generales para arrojar luz sobre su identidad. Primero, cultivamos muestras orales en condiciones aeróbicas y anaeróbicas en tres medios utilizados para cultivar diversas bacterias (métodos), con la esperanza de enriquecerlas con RBS. Desafortunadamente, las RBS no fueron visibles al inspeccionar los cultivos bajo un microscopio, lo que indica que los requisitos de crecimiento de las RBS son distintos de los de las bacterias típicas aisladas de la microbiota de los mamíferos.

Exploramos más a fondo el potencial de cultivar RBS directamente sobre superficies sólidas. Entre las muestras de hisopo de 2022, almacenamos cinco en glicerol al 20 % inmediatamente después de la recolección para maximizar las posibilidades de mantener la viabilidad de la RBS. La microscopía unicelular identificó dos reservas de glicerol que contenían muestras con numerosos RBS. Estas reservas se inocularon en placas de agar que contenían medio BSTSY-FBS o BHI-sangre (Métodos). Las placas BSTSY-FBS permiten el crecimiento de S. muelleri y se incubaron aeróbicamente a 37 °C. Las placas de sangre BHI se utilizan normalmente para cultivar una variedad de comensales bacterianos de mamíferos; Estas placas se incubaron anaeróbicamente a 37 °C. Después de 3 semanas de incubación prolongada, no se observaron colonias en las placas BSTSY-FBS, mientras que una muestra de control de S. muelleri formó colonias grandes después de 1 a 2 días. Las placas de sangre BHI contenían en conjunto ~300 colonias, de las cuales examinamos 288 mediante microscopía unicelular de alto rendimiento38. Ninguna de las colonias contenía células con morfología similar a las RBS. En conjunto, si bien es decepcionante desde el punto de vista de permitir enfoques genómicos, nuestra incapacidad para cultivar RBS proporciona un respaldo adicional de que no son S. muelleri, que es fácilmente cultivable utilizando tales enfoques.

Nuestra siguiente estrategia empleó minimetagenómica, un enfoque en el que se toman submuestras de una pequeña cantidad de células de una comunidad compleja y su ADN se amplifica mediante amplificación por desplazamiento múltiple (MDA). En particular, este enfoque evita en gran medida sesgos preconcebidos sobre una posible identidad, ya que los análisis metagenómicos deberían revelar el ADN de cualquier célula de cualquier dominio de la vida, suponiendo que la lisis celular sea exitosa. Utilizamos tres técnicas para capturar RBS-A para la secuenciación genómica: microdisección por captura láser, microfluidos y micromanipulación celular. Debido a su gran tamaño en comparación con otras bacterias, su baja densidad y la propensión de las RBS-A a adherirse a otras células y a superficies abióticas, solo la micromanipulación condujo a una captura exitosa de RBS-A (Figura 1 complementaria). Además de los cuatro tubos de recolección, cada uno de los cuales contenía entre 1 y 3 RBS-A, se recolectaron cuatro tubos de control negativo de líquido de muestra con la micropipeta sin células visibles con la resolución de nuestro microscopio. Probablemente también se recolectaron ADN libre de células y células pequeñas no objetivo junto con las RBS-A, dada la frecuente proximidad de las RBS-A a otras células. El ADN de muestras positivas para RBS-A y negativas para RBS se amplificó utilizando MDA, se coensambló y se clasificó en 18 contenedores de genoma (Figura complementaria 3 y Tablas complementarias 3 y 4; Métodos). En particular, no se recuperaron genomas de S. muelleri, de la familia Neisseriaceae ni de diatomeas, aunque no se incluyeron controles positivos para estos taxones en el diseño experimental. Los contenedores eucariotas coincidían con el genoma humano o la clase de hongos Malasseziomycetes, cuyos miembros son comensales conocidos de la piel humana40 y, por lo tanto, pueden representar contaminantes. No se recuperaron contenedores de arqueas.

Como la mitad de los contenedores bacterianos candidatos recuperados del experimento de minimetagenómica eran miembros del filo Proteobacteria, a continuación realizamos experimentos FISH utilizando un conjunto de sondas específicas de clase dirigidas a alfa, beta y gammaproteobacteria. Las RBS mostraron unión positiva solo a sondas de clase Betaproteobacteria (Fig. 3).

Se evaluó la capacidad de hibridación con RBS de sondas para las clases de proteobacterias Alphaproteobacteria (ALF968), Betaproteobacteria (BET42a) y Gammaproteobacteria (GAM42a). Fila superior: imágenes de contraste de fase; tres filas centrales de arriba a abajo: imágenes de fluorescencia para sondas de clase Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria y Gammaproteobacteria, respectivamente; fila inferior: tinción DAPI de presunto ADN. Las flechas resaltan las celdas relevantes en las muestras. Las RBS del morfotipo "A" (Fig. 1h) se hibridaron con la sonda de clase Betaproteobacteria y exhibieron una hibridación mínima con las sondas de clase Alphaproteobacteria y Gammaproteobacteria.

Sintetizamos conocimientos sobre la identidad taxonómica de RBS-A a partir de cada línea de evidencia experimental (Fig. 4). Si bien no se pueden extraer conclusiones concluyentes sobre la identidad de RBS-A, los resultados de FISH sugirieron una afiliación con la clase Betaproteobacteria, y se recuperó un único genoma parcial de la clase Betaproteobacteria de los experimentos de minimetagenómica; la afiliación de este contenedor (número 16) con la familia Alcaligenaceae se confirmó mediante análisis filogenético de los genes del ARNr 16S y de la proteína ribosómica S3 (Figuras complementarias 4 y 5 y Métodos). Un ASV compatible con el gen 16S rRNA de ese contenedor está presente en 11/13 de las muestras en las que se confirmó visualmente la presencia de RBS-A y para las cuales hay datos de secuenciación de amplicones disponibles.

La tabla muestra los 18 contenedores recuperados de MDA y la secuenciación de muestras de RBS-A recolectadas mediante un micromanipulador, junto con el filo del que se infiere que derivan. Para la identidad taxonómica más baja lograda (o clase, en el caso del filo polifilético Proteobacteria), un asterisco (*) denota menor confianza en la asignación (Métodos). El panel RBS-A muestra la abundancia relativa de contenedores en cada una de las cuatro muestras que contenían RBS-A según la visualización, codificados por colores de la siguiente manera: verde: ≥5%, amarillo: ≥1% y <5%, naranja: > 0% y <1%, rojo: 0%. El panel de control negativo (Neg) presenta la misma información para cada una de las muestras que no parecían contener RBS-A. Se muestran los criterios para medir la probabilidad de que un contenedor se derive de RBS-A: (Genómica) ¿Estuvo el contenedor alguna vez presente en los controles negativos (verde = no, amarillo = sí pero nunca ≥1% de abundancia relativa, naranja = sí pero nunca ≥ 5%, rojo = sí y al menos una vez ≥5%)? (Tinción de Gram) ¿Se sabe que los miembros de este grupo taxonómico son Gram negativos, como los RBS? (16S 75 %+) De los ASV detectados en >75 % de las muestras que se sometieron a secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA y se confirmó visualmente que contenían >10 RBS-A (n = 13), ¿era un ASV de esta identidad taxonómica? Los números en los cuadros indican la cantidad de muestras en las que estuvo presente este ASV. Para los contenedores recuperados detectados solo al nivel de la clase Gammaproteobacteria, un grupo grande y diverso, este criterio está marcado en amarillo y no se muestran los recuentos de ASV. (FISH) Según los resultados de FISH, ¿qué contenedores se admiten como candidatos potenciales para las RBS-A? Una cruz (†) denota que a partir de estudios genómicos se infiere que los miembros del filo Gracilibacteria no son Gram negativos (aunque no son necesariamente Gram positivos)92. Los candidatos con mayor probabilidad son verdes para los tres criterios.

El camino evolutivo hacia la multicelularidad y la división longitudinal no se conoce bien. Esfuerzos recientes para identificar la base genética de estas características bacterianas en la familia Neisseriaceae encontraron que la adquisición del gen amiC2 que codifica la amidasa, junto con modificaciones en genes reguladores clave (p. ej., mreB, ftsA), probablemente desempeña un papel importante. Buscamos en los contenedores recuperados del experimento de minimetagenómica supuestas proteínas AmiC2 (aquellas que codifican Amidase_3, PF01520); Los candidatos se identificaron en los contenedores 4, 7, 9, 10, 11, 12 y 16 (el último de los cuales está afiliado a Alcaligenaceae). Una vez confirmada la identidad de las RBS, el trabajo futuro debería examinar la importancia de amiC2 para conferir su morfología inusual.

Para obtener información estructural de alta resolución sobre las RBS-A, tomamos imágenes de muestras orales de delfines que contenían altas densidades de RBS-A utilizando crioTEM. Las imágenes crioTEM de bajo aumento revelaron que cada RBS-A consta de segmentos aparentemente emparejados organizados en paralelo (Fig. 5a, b). Estos segmentos estaban orientados de manera similar a las bandas teñidas con DAPI que se ven en imágenes de microscopía de fluorescencia (Fig. 1c, e). Algunos grupos de segmentos parecían estar en el acto de separarse de otros grupos, aunque nuestros datos estáticos no pueden decir definitivamente si estas observaciones reflejaban la división celular. Los segmentos estaban rodeados por una capa densa similar a una membrana debajo de una capa de baja densidad (Fig. 6a, b (derecha) y Fig. 7a; Películas complementarias 2 y 3).

Imágenes a, b o imágenes crioTEM de montaje c de RBS con filtro de paso de banda y eliminación de ruido de bajo aumento en una rejilla TEM de carbono con orificios R2/2. Imágenes de mayor aumento que muestran apéndices tipo pilus d y células e proximales y vesículas que interactúan en la periferia de la RBS. En (a), los pares de segmentos se resaltan con tonos de azul alternos y las hendiduras pronunciadas entre grupos de segmentos se indican con flechas negras. Había objetos esferoidales densos dentro de las RBS (flecha blanca). En (d), los segmentos están encapsulados por una membrana interna (IM) y una membrana externa (OM), indicadas por flechas negras. d, e Micrografías representativas que muestran que las RBS a menudo estaban muy cerca física de otras células en las muestras. En (e), una pequeña hendidura aparente (flecha negra) en la superficie periódica de RBS que cubre se superpone con una célula o vesícula que no es de RBS. Las pequeñas manchas oscuras (15 nm) en (c – e) son partículas fiduciales de oro utilizadas para la alineación de series de inclinación en experimentos de crioET (flecha negra).

a, b, d, e Ejemplos de cortes de ~3 nm de espesor a dos profundidades diferentes (a versus b, d versus e) de cada uno de dos tomogramas RBS-A representativos. c, f Anotaciones manuales correspondientes de funciones celulares. Las tomografías son gruesas (~500–600 nm) y, como tales, los apéndices en forma de pilus (amarillo: c, f) eran visibles solo a cierta profundidad dentro de la densidad de volumen tomográfico de la RBS-A. Consulte también las películas complementarias 2 y 3. c, f Azul, membranas internas; cubierta superficial periódica de color púrpura; membrana exterior verde; rojo, matriz. Barras de escala, 100 nm.

una imagen única de cryoTEM. b, c Rebanadas CryoET (~ 3 nm de espesor) de un RBS-A. Los cuadros rojos y naranjas en (c) son vistas ampliadas de haces de apéndices, y las flechas indican apéndices delgados y únicos. d Imagen crioTEM 2D representativa en el borde de un RBS-A que muestra una cobertura superficial periódica. Los perfiles de densidad de línea a lo largo de regiones seleccionadas de la imagen en (d) muestran que el espaciado de las características repetitivas es de ~7 a 9 nm a lo largo de una dirección paralela a la membrana RBS-A.

Nuestra hipótesis es que las RBS son probablemente agregados de células, y que cada segmento que contiene ADN corresponde a una célula individual. Las siguientes observaciones apoyan esta hipótesis: (1) cada segmento individual parecía estar rodeado por una membrana interna y externa, que recuerda al plasma y la membrana externa que se ven en otras bacterias Gram-negativas (Figs. 5a, 6a, b (derecha) y 7a); (2) los segmentos están dispuestos en la misma geometría (Fig. 5a, b) que las bandas teñidas con DAPI y las bandas hibridadas con sonda FISH (Figs. 1c, e, gy 3); (3) apéndices sobresalían de la superficie de segmentos individuales (Fig. 5c, d); (4) RBS-As a menudo consistía en un número variable de segmentos que parecían separarse entre sí (Figs. 1d, e y 6d, e), lo que sugiere que las estructuras rectangulares no reflejan células individuales; (5) los segmentos vecinos aparecieron en forma de H (Fig. 1g), que recuerdan a los nucleoides que se segregan en una célula bacteriana que se somete a división longitudinal; y (6) si bien un informe reciente describe el primer descubrimiento de una bacteria en la que el ADN se almacena en un compartimento rodeado de membrana41, el número de especies bacterianas conocidas en las que el ADN está físicamente segregado del citoplasma, y ​​mucho menos unido a orgánulos, es extremadamente bajo. Por el contrario, la multicelularidad se ha documentado en diversas especies bacterianas (revisada en la referencia 42).

Se observaron estructuras esféricas oscuras en el cuerpo de las RBS en imágenes crioTEM (Fig. 5c). En una tomografía, dos objetos esferoidales densos eran claramente visibles y medían 192 nm × 200 nm × 192 nm (volumen 3,1 × 107 nm3) y 215 nm × 220 nm × 220 nm (volumen 4,4 × 107 nm3). También eran evidentes estructuras similares a vesículas. En particular, una cubierta de superficie con una periodicidad de ~ 7 a 9 nm encapsuló los RBS-A (media 7,83 ± 0,86 nm SD) (Figs. 6 y 7 y películas complementarias 2 y 3). Esta característica se midió a partir de micrografías 2D de alta resolución de dos RBS-A de una sola muestra oral de delfines generando gráficos de densidad de líneas de segmentos (2 de cada imagen) y midiendo manualmente la distancia entre los picos de intensidad para 6 a 7 picos ( Figura 7d, e).

Para obtener reconstrucciones 3D más detalladas de las características de RBS-A, realizamos experimentos crioET. Las adquisiciones de series de inclinación se limitaron a la periferia de RBS-A ya que el grosor de los cuerpos de RBS-A ocluyeron el haz de electrones casi por completo en ángulos de inclinación elevados. El espesor en la periferia de RBS-A (<1 μm desde el borde) osciló entre ~323 y 751 nm, con un valor promedio de ~509 ± 132,4 nm SD (n = 15), (por encima del umbral de ~500 nm comúnmente considerado como límite superior para la obtención de imágenes crioET productivas43). Los intentos de obtener imágenes del cuerpo de RBS-A con crioET fracasaron porque los fiduciales de oro y las características celulares rápidamente se volvieron imperceptibles al inclinarse, lo que sugiere que el grosor de la muestra indujo demasiados eventos de dispersión múltiples44.

De las RBS-A sobresalían apéndices que se parecían a pili45,46; Estos apéndices a menudo consistían en estructuras parecidas a pelos que formaban haces y se extendían en las puntas, a veces entrelazándose y/o cruzándose entre sí (Figs. 6b y 7b, c). Los haces de apéndices eran estructuralmente heterogéneos, con longitudes, anchos de haz y número de puntas variables. En particular, al examinar las diversas características de las tomografías, no observamos ningún orgánulo rodeado de membrana que recuerde a un núcleo, lo que corresponde a una identidad no eucariota.

Tanto para los apéndices como para la cobertura periódica de la superficie, el promedio del subtomograma47 no produjo mapas consistentes, probablemente debido al grosor de la periferia de la RBS-A (a menudo >500–600 nm de espesor), la baja relación señal-ruido de los tomogramas y características limitantes de las características en cuestión, como la curvatura variable de las regiones con tramos de cobertura superficial periódica continua. El promediado exitoso de subtomogramas generalmente se basa en promediar estructuras idénticas, por ejemplo, copias repetidas de un complejo macromolecular, como ribosomas en el mismo estado funcional. Se puede compensar la variabilidad estructural en forma de heterogeneidad conformacional y compositiva con grandes conjuntos de datos compuestos por miles de subtomogramas en combinación con métodos de clasificación avanzados. Sin embargo, en nuestros conjuntos de datos, tanto los apéndices en forma de pilus (Fig. 7a-c) como la característica de superficie en forma de capa S (Fig. 7a, d, e) eran estructuralmente heterogéneos y escasamente distribuidos en las RBS-A (p. ej. , la característica de la superficie similar a una capa S no es continua a lo largo de toda la membrana del RBS-As y, en los tramos donde lo es, exhibe una curvatura diferencial) y, por lo tanto, se observaron solo en una fracción de nuestras tomografías.

Para abordar el espesor de la muestra, utilizamos microscopía electrónica de barrido (SEM) de haz de iones enfocado criogénico (FIB)48 para moler laminillas más delgadas de muestras de RBS49. Sin embargo, no pudimos localizar ningún RBS-A debajo del hielo, por dos posibles razones: (1) con un espesor inferido entre ~0,6 y 1,7 µm, es posible que los RBS-A no formen "montículos" debajo del hielo que sean lo suficientemente protuberantes como para sugerir dónde fresar; y (2) otras células más grandes en las muestras (como las células epiteliales de delfines) formaron montículos más prominentes que oscurecieron las RBS-A. De hecho, ninguna de las láminas que produjimos en las ubicaciones candidatas contenía RBS-A. Los datos de este experimento sugieren que la microscopía criocorrelativa de luz y electrónica (cryoCLEM) será necesaria en futuros estudios para localizar regiones candidatas en rejillas crioEM con RBS-A vitrificados a partir de las cuales producir laminillas delgadas utilizando crioFIB-SEM. No obstante, la superficie celular exhibió características similares a las que observamos en la periferia de RBS-A, a saber, pili y capas S. Sugerimos que los apéndices en forma de pilus y la cubierta superficial periódica en forma de capa S de RBS-A merecen una investigación futura.

Aquí, utilizamos microscopía óptica, crioTEM y crioET para buscar una nueva diversidad morfológica dentro de la microbiota de muestras orales de delfines. La diversidad morfológica se predijo basándose en hallazgos previos de nueva diversidad filogenética y potencial funcional en la boca del delfín mediante estudios basados ​​en secuenciación16,23. Curiosamente, descubrimos RBS inusuales. Inferimos que ambos morfotipos de RBS son autóctonos de la boca de los delfines dado que estuvieron constantemente presentes en este entorno: se identificaron RBS-A y RBS-B en 39/73 y 42/73 muestras, respectivamente, que fueron encuestadas utilizando sistemas de alto rendimiento. imágenes de microscopía, incluidas las de 7/8 y 6/8 delfines incluidos en este estudio, y estuvieron presentes en muestras recolectadas durante intervalos de diez años de diferencia. Estudios anteriores han encontrado que la microbiota de los mamíferos marinos es distinta de la del agua de mar (incluso la de la piel, que está constantemente en contacto directo con el agua de mar)23,50 y, por lo tanto, es poco probable que las RBS sean simplemente contaminantes del agua de mar.

La identificación taxonómica de morfotipos celulares específicos de comunidades complejas puede resultar extremadamente difícil, hasta el punto de que a menudo queda sin resolver28,51,52. Los resultados recopilados aquí sugieren fuertemente que las RBS-A no están afiliadas a los miembros multicelulares de la familia Neisseriaceae que se dividen longitudinalmente, S. muelleri, género Conchiformibius o género Alysiella, que también pueden formar grupos de células en forma de bastón de forma rectangular53. En primer lugar, el flujo de trabajo de secuenciación de amplicones del gen marcador empleado aquí no detectó ningún amplicón de la familia Neisseriaceae en 54 muestras orales de delfines que se sometieron a una secuenciación profunda de amplicones del gen 16S rRNA, aunque este flujo de trabajo sí detectó S. muelleri después de que las células de este taxón se insertaron intencionalmente en alícuotas de Muestras orales de delfines. En segundo lugar, los intentos de cultivar RBS-A utilizando técnicas que se emplearon con éxito en nuestro laboratorio para cultivar S. muelleri fracasaron, lo que sugiere que los RBS-A tienen requisitos fisiológicos de crecimiento diferentes a los requeridos por S. muelleri. En tercer lugar, no se recuperó ningún genoma de la familia Neisseriaceae del experimento de minimetagenómica. En cuarto lugar, comparaciones visuales de las imágenes RBS-A presentadas aquí con las imágenes de microscopía de fluorescencia y TEM de la familia Neisseriaceae multicelular que se divide longitudinalmente (géneros Alysiella, Simonsiella y Conchiformibius) en la ref. 53 sugieren que son taxones diferentes. Por ejemplo, las RBS parecen contener segmentos (células) que están incrustados en un material similar a una matriz y completamente encapsulados por una estructura similar a una capa S, mientras que la familia Neisseriaceae, multicelular que se divide longitudinalmente y pertenece al mismo filamento, solo parece compartir su membrana externa53. .

Los experimentos FISH indicaron que los RBS-A son bacterianos y probablemente miembros de la clase Betaproteobacteria. Se recuperó el genoma de una clase Betaproteobacteria del experimento de minimetagenómica de la familia Alcaligenaceae. Se detectó un ASV que coincidía con el gen de ARNr 16S de este contenedor en 11/13 muestras que se sometieron a secuenciación de amplicones y se confirmó visualmente que contenían RBS-A mediante microscopía de contraste de fases. En conjunto, los RBS-A pueden ser miembros de la familia Alcaligenaceae, aunque el hallazgo de que este ASV estaba ausente en 2/13 muestras confirmó que contenía RBS-A mediante microscopía desafía esta hipótesis. Una posibilidad es que los RBS-A estuvieran presentes en una abundancia relativa suficientemente baja en esas dos muestras como para no ser detectados, a pesar de la secuenciación profunda de amplicones. Otra posibilidad es que los RBS-A no sean este taxón de Alcaligenaceae, sino que el taxón de Alcaligenaceae sea un miembro ubicuo de la microbiota oral de los delfines y, por lo tanto, apareció con frecuencia en nuestros análisis basados ​​en secuenciación. En tal caso, sugeriría que las RBS-A son Betaproteobacterias de clase que no se lisaron en los experimentos basados ​​en secuenciación o que los resultados de FISH fueron un falso positivo, a pesar de las condiciones estrictas y controladas bajo las cuales se realizó el experimento.

Obtener una identificación a nivel de especie para las RBS mediante métodos basados ​​en secuenciación será extremadamente desafiante por numerosas razones, como la frecuente proximidad de las RBS con otras células pequeñas que probablemente se mezclaron con las RBS durante la micromanipulación o la reticencia a la lisis de laboratorio. Es importante destacar que dudamos en excluir las identidades de los candidatos por no estar presentes en el experimento de minimetagenómica en todas las muestras positivas de RBS, ya que las limitaciones técnicas podrían haber dado lugar a falsos negativos. Por ejemplo, una pared celular gruesa o una obstrucción que impida que los reactivos lleguen al RBS mediante la aguja de la micropipeta podría haber interferido con la lisis de la membrana celular e impedido la extracción de ADN. Por el contrario, es posible que haya surgido un resultado positivo en un control negativo debido a un mapeo de lectura no específico, contaminación de contenedores del genoma con material de contaminantes verdaderos o ADN libre de células. Los enfoques basados ​​en el cultivo pueden ser, en última instancia, la ruta más prometedora para identificar las RBS, aunque probablemente será necesario probar muchas combinaciones de parámetros para encontrar condiciones satisfactorias para el crecimiento de las RBS. Independientemente de la identidad taxonómica de las RBS, las nuevas características estructurales que han evolucionado en estos microorganismos son intrigantes y resaltan el potencial de descubrimiento para futuros estudios.

La naturaleza emparejada de los segmentos en las RBS probablemente pueda atribuirse a su modo longitudinal de fisión binaria, como se observa en los géneros Alysiella, Simonsiella y Conchiformibius de la familia Neisseriaceae, así como en S. poulsonii, Ca. T. oneisti y Ca. T. hypermnestrae31,32,35,54. En el miembro de la familia Neisseriaceae, S. muelleri, se cree que las láminas ayudan a las células a permanecer físicamente ancladas en la cavidad bucal cuando las células epiteliales que se desprenden rápidamente se desprenden 34. Presumimos que lo mismo puede ser cierto para las RBS, que habitan en un entorno similar y cuya morfología puede haber experimentado una evolución convergente debido a presiones evolutivas similares. La fisión binaria longitudinal puede ser una característica aún más general que se selecciona en respuesta a la necesidad de formar una unión segura a un sustrato. Los segmentos en los extremos de las RBS suelen ser más cortos que los más cercanos al centro, lo que sugiere que puede haber un mecanismo por el cual el crecimiento de los segmentos está determinado por su posicionamiento espacial dentro de una RBS. Las RBS presentan otro ejemplo de caso para futuros estudios evolutivos centrados en comprender los impulsores y las bases genéticas de la multicelularidad bacteriana y la división longitudinal.

Las imágenes de CryoTEM sugirieron que los RBS-A están encapsulados por una cubierta superficial periódica, que puede ser una capa S o una nueva estructura cristalina. Las capas S son conjuntos cristalinos autoensamblados de proteínas o glicoproteínas individuales que recubren el exterior de algunas bacterias y arqueas55,56. Si bien su función exacta varía ampliamente entre microorganismos y a menudo se desconoce, se supone que las capas S confieren funciones beneficiosas dado su alto costo metabólico (la capa S comprende hasta ~20% de la proteína total sintetizada por las células), su ubicuidad en todos los microorganismos y a menudo se desconoce. microbios y sus múltiples orígenes evolutivos55,56. Si los segmentos en RBS-A corresponden a células individuales, la producción de la cubierta superficial periódica puede representar la cooperación entre células dentro de RBS-A. La síntesis cooperativa de una única superficie periódica compartida que cubre múltiples células podría haber evolucionado ya que los parientes cercanos (otras células en una RBS-A) tienen una capacidad de dispersión limitada y, por lo tanto, están situadas en estrecha proximidad física. Las RBS-A se beneficiarían de la producción cooperativa de una única superficie periódica que cubra alrededor de una población de células en lugar de alrededor de cada segmento individual al reducir el área de superficie requerida para cubrir todas las células, y tal ventaja podría incluso haber contribuido a la selección para la agregación. Una posibilidad adicional y no mutuamente excluyente es que la cobertura periódica de la superficie pueda ayudar a mantener la ultraestructura de los segmentos dentro de una RBS-A, similar a arqueas como Thermoproteus tenax57.

Una de las características más llamativas de los RBS-A son sus apéndices en forma de pilus. En la actualidad, existen cinco clases caracterizadas de pili en bacterias Gram negativas (acomodador acompañante, fibras curli, tipo F, tipo IV y tipo V) y dos tipos generales de pili en bacterias Gram positivas (bacilos cortos y delgados). y filamentos más largos, flexibles y parecidos a pelos)45,46; Se han documentado otros apéndices parecidos a pilus, como hami en archaea21. Hasta donde sabemos, los pili bacterianos caracterizados consisten en apéndices únicos que existen como unidades independientes. Por el contrario, los apéndices en forma de pilus que sobresalen de los segmentos RBS-A exhiben una arquitectura inusual que involucra haces heterogéneos de filamentos que a menudo se extienden en las puntas. Estas observaciones plantean la cuestión de si los apéndices RBS-A representan un tipo novedoso de ensamblaje de subunidades de pilin o son una clase de apéndices completamente distinta.

Una investigación exhaustiva de cientos de imágenes crioEM y docenas de tomogramas crioET permitió la visualización de la estructura de muchas características de RBS-A con una resolución cercana al nanómetro. Los estudios futuros de RBS pueden beneficiarse de la obtención de imágenes con óptica de placa de fase que aumenta drásticamente el contraste de la imagen58 después de métodos de preparación de muestras que adelgazan las células hasta convertirlas en laminillas mediante fresado FIB junto con SEM a temperaturas criogénicas48,49. Nuestros datos sugieren que será necesario crioCLEM para permitir la producción de laminillas delgadas para RBS-A, ya que el cuerpo celular de RBS-A parece ser más grueso que el límite permitido para los experimentos de crioET y, sin embargo, demasiado delgado para que RBS-A se encuentre fácilmente. por crioSEM antes de la molienda crioFIB sin etiquetas fluorescentes. Los experimentos exitosos de crioCLEM+cryoFIB-SEM seguidos de crioET podrían permitir análisis más completos de la comunidad de RBS y su cuerpo celular más allá de la delgada periferia, así como la visualización de componentes subcelulares de interés con mayor resolución mediante un promedio de subtomogramas.

La gran mayoría de los microorganismos de la Tierra carecen de representantes aislados19. Los análisis basados ​​en secuenciación han demostrado ser invaluables para explorar y describir dicha diversidad, pero no pueden usarse para explorar todos los aspectos de la biología de los microorganismos. Los puntos ciegos notables en nuestra comprensión de los organismos no cultivados incluyen los genes únicos y las características estructurales y funcionales correspondientes que han evolucionado dentro de estos linajes. Si bien el uso de técnicas de imagen avanzadas para visualizar microbios puede proporcionar información sobre la biología de linajes no cultivados, será necesario un cambio hacia un enfoque más multifacético que aproveche muchas disciplinas y técnicas para crear una visión integral de esta materia oscura biológica59,60.

Para maximizar la reproducibilidad, en la Tabla complementaria 5 se proporciona una lista de los reactivos y recursos utilizados en este estudio, así como su fuente e identificador.

Se obtuvieron muestras de hisopos orales de delfines mulares (Tursiops truncatus) administrados por la División de Biociencias MMP de la Marina de los EE. UU., Centro de Sistemas de Guerra Espacial y Naval del Pacífico, San Diego, EE. UU. La primera muestra que contenía RBS se recolectó el 1 de abril de 2012 y la última el 24 de marzo de 2022. Las muestras de hisopo se obtuvieron utilizando hisopos de recolección de muestras Catch-All de espuma estéril (Epicenter, WI, Cat. #QEC091H). Las muestras recolectadas en 2012 se obtuvieron frotando el surco gingival izquierdo. Las muestras recolectadas en 2018 se obtuvieron frotando el paladar, la lengua y el surco gingival izquierdo (las tres superficies para cada hisopo). Las muestras recolectadas en 2022 se obtuvieron del paladar, la superficie bucal o el surco gingival izquierdo. De las 2022 muestras del surco gingival, 5 se almacenaron en glicerol al 20%. Todas las demás muestras de hisopo se congelaron en seco. El protocolo de muestreo se adhirió a las pautas descritas en el Manual de Medicina de Mamíferos Marinos del CRC.

El MMP está acreditado por la Asociación Internacional para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio y se adhiere a los estándares nacionales de la Política del Servicio de Salud Pública de los Estados Unidos sobre el Cuidado Humanitario y el Uso de Animales de Laboratorio y la Ley de Bienestar Animal. Según lo exige el Departamento de Defensa de EE. UU., el programa de uso y cuidado de animales del MMP es revisado de forma rutinaria por un Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales (IACUC) y por la Oficina de Medicina y Cirugía de la Marina de EE. UU. El protocolo de uso y cuidado de animales para delfines MMP en apoyo de este estudio fue aprobado por la IACUC del MMP y la Oficina de Medicina y Cirugía de la Marina (IACUC #92-2010, BUMED NRD-681).

Para separar las células de los hisopos, los hisopos se sumergieron en 1X PBS (~50–100 µL, dependiendo de la densidad celular) en tubos de microcentrífuga. Los tubos se agitaron vigorosamente durante aproximadamente 10 segundos y se centrifugaron ligeramente para eliminar el líquido de las tapas de los tubos. La solución resultante se utilizó para microscopía.

Se colocó aproximadamente 1 µL de solución celular en PBS en una almohadilla de agarosa (1% de agarosa en PBS) y se tomaron imágenes con un microscopio invertido Eclipse Ti-E con un objetivo de 100X (NA: 1,4) (Nikon, Tokio, Japón). Para determinar la localización del ADN, las células se tiñeron con DAPI a una concentración final de 0,5 μg ml-1 durante 5 minutos antes de la obtención de imágenes utilizando espectros de emisión/excitación de 340/488 nm. Se lograron imágenes automatizadas de alto rendimiento de muestras orales de delfines mediante microscopía de contraste de fases utilizando el Strain Library Imaging Protocol38 para capturar 226 campos de visión para cada una de las muestras recolectadas en 2018, y 100 campos de visión para las recolectadas en 2022.

La tinción de Gram se realizó utilizando un kit de tinción de Gram (Sigma Aldrich, n.º de catálogo 77730-1KT-F) siguiendo el protocolo del fabricante. Se tomaron imágenes de las células utilizando un microscopio de campo brillante con un objetivo de 100X (Nikon). Se aplicó tinte FM4-64 (ThermoFisher Scientific, cat. #T13320) directamente a muestras de hisopos orales de delfines siguiendo el protocolo del fabricante. El tinte FM4-64 no tiñó ninguna parte de las RBS.

Se aplicó una solución de células en PBS (2,5 µL) a rejillas Quantifoil de carbono con orificios y cobre de malla 200 con descarga luminosa (Quantifoil, Großlöbichau, Alemania, n.º de catálogo Q2100CR1) o a rejillas GridFinder Quantifoil de oro (Quantifoil, Großlöbichau, Alemania). Cat. #LFH2100AR2), seguido de la aplicación de 2 µL de solución fiducial de oro de 15 nm a ambos lados de cada rejilla. Las rejillas se secaron durante 5 segundos y se congelaron en etano líquido enfriado con nitrógeno líquido a aproximadamente -195 ° C utilizando un congelador EM GP Plunge (Leica, Wetzlar, Alemania).

Las muestras se cargaron en uno de dos microscopios: un Titan Krios G3 operado a 300 kV con un filtro de energía (ancho de rendija de 20 eV) o un Titan Krios G4 operado a 300 kV sin filtro de energía. Ambos microscopios estaban equipados con un dispositivo de detección directa de electrones K2 Summit (Gatan, Pleasanton, EE. UU.) utilizado para registrar micrografías. Los datos se adquirieron de forma semiautomática en modo de conteo utilizando SerialEM (v. 3.8)61. Los parámetros de imágenes CryoEM/ET se proporcionan en la Tabla complementaria 6.

Los montajes se combinaron y agruparon 4 veces o más utilizando el algoritmo “blendmont” IMOD v. 4.12.962 y se normalizaron, filtraron paso de banda, rotaron y recortaron para fines de visualización utilizando EMAN2 v. 2.3963. Quince de dieciséis series de inclinación eran adecuadas para la reconstrucción tomográfica en IMOD v. 4.12.9. Las series de inclinación con muestreo a 7,5 Å píxel-1 se redujeron al doble y aquellas con muestreo a 3,48 o 3,75 Å píxel-1 se redujeron al cuádruple. Las imágenes con artefactos como carga excesiva, deriva, gran contaminación de hielo arrastrándose en inclinaciones altas o espesor excesivo en inclinaciones altas se excluyeron de 12 de las series de inclinación antes de la alineación manual basada en fiduciales de oro; Se eliminaron hasta 13 imágenes de las 41 de la serie original de inclinación sin formato.

Las tomografías se reconstruyeron utilizando retroproyección ponderada estándar y un filtro tipo SIRT (que imita 16 iteraciones) y se filtraron con paso de banda y se agruparon al doble en la mayoría de los casos para anotación de funciones, segmentación, producción de películas y otros fines de visualización. . El espesor del tomograma se estimó identificando visualmente los cortes z más pequeños y más grandes con RBS-A visible o densidades de contaminación por hielo y convirtiendo el número de cortes a nanómetros. Se intentó promediar el subtomograma utilizando EMAN2 v. 2.3964,65 para densidades globulares sospechosas de ser ribosomas, densidades de matriz debajo de la membrana externa, parches de la cubierta superficial periódica y regiones de apéndices similares a pilus, pero no hay estructuras interpretables con una resolución mejor que ~ Se obtuvieron 50 Å. Los rangos de grosor y longitud de los apéndices en forma de pilus se obtuvieron escaneando visualmente los cortes en las tomografías en busca de los filamentos individuales más delgados y los haces más gruesos perceptibles a simple vista y midiendo sus dimensiones en cortes tomográficos agrupados en 4 usando el instrumento de medición. herramienta de cinta de EMAN2 e2display.py. La distancia de repetición de la cobertura de la superficie periódica se midió manualmente de manera similar a los apéndices en forma de pilus de los cortes tomográficos, con ~10 a 20 mediciones de cada una de las tres tomografías que muestran al menos regiones pequeñas donde la repetición era discernible. Esta cuantificación arrojó un rango entre ~6 y 10 nm, lo que sugiere que los componentes de la capa son flexibles o que la estructura subyacente puede producir diferentes distancias aparentes entre sus subunidades dependiendo del ángulo en el que se corta. Además, las regiones que mostraban el patrón mucho más claramente en imágenes de proyección bidimensionales de montaje con mayor aumento se recortaron, se rotaron para que quedaran en un plano horizontal, se filtraron y enmascararon para calcular perfiles de densidad de líneas paralelos a la membrana exterior.

Inicialmente llevamos a cabo anotaciones tomográficas de tres características (cobertura superficial periódica, membranas lipídicas y apéndices similares a pilus) para tres tomografías utilizando la tubería semiautomática basada en red neuronal bidimensional de EMAN266 y realizamos una limpieza manual de falsos positivos en UCSF Quimera v.1.1667. Los mapas de probabilidad de anotación de salida de EMAN2 v. 2.39 se convirtieron en segmentaciones aplicando un umbral determinado visualmente y multiplicando las tomografías de contraste invertido por el mapa de anotación con umbral. Las segmentaciones se filtraron de paso bajo con EMAN2 v. 2.39 para suavizar el ruido. Sin embargo, dado que las anotaciones semiautomáticas no capturaron la complejidad de las estructuras subcelulares, aplicamos un proceso similar para generar segmentaciones de cinco características (apéndices en forma de pilus, cobertura superficial periódica, membrana externa, matriz y membranas internas) utilizando métodos manuales. anotaciones realizadas con IMOD v. 4.12.9, siguiendo un protocolo reciente que aumenta la eficiencia de la anotación manual68. Las instantáneas de la Fig. 6 que muestran las características de RBS-A en color, así como las películas complementarias 2 y 3 que muestran los resultados de la segmentación, se produjeron con UCSF Chimera v. 1.16.

Primero identificamos una cuadrícula que contenía RBS-A mediante microscopía óptica. Utilizando un Aquilous CryoFIB (ThermoFisher Scientific, MA, EE. UU.), creamos cinco laminillas usando una corriente de 30 kV, 30 pA y un tiempo de duración de 5 µs. Luego, las muestras se cargaron en un crioTEM para la observación de muestras y la recopilación de datos. No pudimos identificar RBS en las laminillas.

Se prepararon como controles cultivos celulares de Escherichia coli MG1655 axénica, Skeletonema costatum LB 2308 no axénica (Colección de cultivos de algas UTEX de la Universidad de Texas en Austin, Austin, TX, EE. UU.), Caulobacter crescentus CB15N y Simonsiella muelleri ATCC 29453. E. coli se cultivó en caldo LB y se cultivó a 37 °C, S. costatum se cultivó en medio de Erdschreiber a 20 °C con un ciclo de ~12 h de luz y ~12 h de oscuridad, C. crescentus se cultivó en medio PYE a 30 °C. °C, y S. muelleri se cultivó en medio BSTSY (2,75 % (p/v) de caldo de soja tríptico, 0,4 % (p/v) de extracto de levadura, 10 % de suero bovino) a 37 °C.

Todas las sondas FISH se solicitaron a Integrated DNA Technologies (Coralville, EE. UU.) con purificación por HPLC. Las secuencias de sonda y las etiquetas de fluorescencia son las siguientes: Euk-1209: 5'-GGGCATCACAGACCTG-/3Alx660/-3', Bact338: 5'-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-/Alx488/-3', BET42a: 5'-/Alx594/-GCCTTCCCACTTCGTTT- 3', GAM42a: 5'-/Alx488/-GCCTTCCCCACATCGTTT-3', no EUB: 5'-/Cy5/-ACTCCTACGGAGGCAGC-3'.

Las células de los controles y RBS-A se recogieron en tubos de microcentrífuga. Para garantizar una biomasa suficiente a partir de hisopos orales de delfines, se condensaron células de cuatro hisopos en un solo tubo. El protocolo FISH fue adaptado de la ref. 69. Las células se fijaron en 1 ml de solución de formaldehído al 3,7 % (800 µl de agua tratada con DEPC, 100 µl de PBS 10X, 100 µl de formaldehído al 37 %) durante 30 minutos con agitación suave a 700 rpm. Luego, las células se lavaron dos veces en 1 ml de PBS 1X y se permeabilizaron en una mezcla de 300 µl de agua tratada con DEPC y 700 µl de etanol de 200 grados con agitación suave a 700 rpm durante 2 h. Se agregaron sondas a 50 µl de solución de hibridación hasta una concentración final de 1 µM por conjunto de sondas. Para BET42a y GAM42a, la solución de hibridación contenía una solución de formamida al 55 % (4 ml de agua DEPC, 1 g de sulfato de dextrano, 4,85 ml de formamida, 1 ml de SSC 2X, llevado a un volumen total de 10 ml con tratamiento con DEPC). agua); para otras sondas, la solución de hibridación contenía 40 % de formamida (5 ml de agua DEPC, 1 g de sulfato de dextrano, 3,53 ml de formamida, 1 ml de 2X SSC, llevados a un volumen total de 10 ml con agua tratada con DEPC) . Para BET42a y GAM42a, las células se incubaron en 50 µL de tampón de hibridación con sondas a 46 °C durante 1 h; para otras sondas, las células se incubaron durante la noche en 50 µl de tampón de hibridación con sondas FISH a 30 °C. Las células se lavaron dos veces usando una solución de lavado (2 ml de tampón SSC 20X, 7,06 ml de formamida, 10,94 ml de agua tratada con DEPC) y se resuspendieron en tampón SSC 2X. Se montó un microlitro de células en almohadillas de agarosa al 1% que contenían PBS y 5 µg ml-1 de DAPI para obtener imágenes. Los datos de imágenes se procesaron utilizando FIJI v. 2.0.070.

Se seleccionaron cincuenta y cuatro muestras orales de delfines para la secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA. Se extrajo ADN genómico de muestras orales de delfines y 32 controles negativos (PBS) utilizando el kit microbiano DNeasy UltraClean 96 (Qiagen Cat. #10196-4) siguiendo las instrucciones del fabricante. La región 16S rRNA V4 se amplificó utilizando cebadores 515F y 806rB usando Platinum™ II HotStart PCR Master Mix (ThermoFisher Cat. #14000013). Los productos de la PCR se combinaron en volúmenes iguales y se purificaron en gel. La purificación final se realizó utilizando Macherey-Nagel NucleoSpin Gel y PCR Clean-up, Mini Kit (Fisher, Cat. #740609). Los amplicones se secuenciaron en la plataforma Illumina MiSeq con lecturas emparejadas de 250 pb en las instalaciones Stanford Chan Zuckerberg Biohub, lo que dio como resultado una profundidad de lectura mediana de 92 077 lecturas (mín.: 50 772, máx: 265 108).

La demultiplexación se realizó utilizando Bcl2Fastq v. 2 (Illumina, CA, EE. UU.). Los ASV se infirieron utilizando DADA271 v. 1.16.0, siguiendo las pautas del "Big Data Workflow" (https://benjjneb.github.io/dada2/bigdata_paired.html). Las afiliaciones taxonómicas se asignaron utilizando como referencia la base de datos SILVA 138 SSU72. Las lecturas directa e inversa se recortaron a 240 y 180 nt, respectivamente. Este proceso arrojó un total de 1116 taxones y 5.339.751 lecturas en las 54 muestras. Los ASV se analizaron utilizando phyloseq v. 1.28.072.

Para confirmar que nuestro proceso de extracción, amplificación, secuenciación y análisis bioinformático de ADN pudo identificar miembros de la familia Neisseriaceae, realizamos un experimento de aumento. Primero seleccionamos una muestra oral de delfines que contenía RBS-A, según lo determinado por microscopía de contraste de fase. Luego creamos dos alícuotas de esta muestra. A la primera alícuota, le agregamos células de un cultivo puro de S. muelleri en una proporción de 1:1. La otra alícuota quedó intacta. Estas dos muestras, junto con una alícuota del cultivo puro de S. muelleri (control positivo), se sometieron a extracción de ADN, amplificación por PCR y protocolo de secuenciación como se describe anteriormente. Las tres muestras se secuenciaron en una única ejecución de Illumina MiSeq, que no estaba en el mismo carril que las otras muestras de amplicones de este estudio. Tenga en cuenta que al amplificar por PCR S. muelleri en el mismo entorno de laboratorio que la muestra de control negativo y luego secuenciarla en el mismo carril, se espera cierta contaminación cruzada. La primera vez que se secuenció la muestra de control negativo (en ausencia de cultivos puros de S. muelleri en el laboratorio), no se detectaron amplicones de la familia Neisseriaceae.

Para obtener identidades candidatas para RBS-A, empleamos un enfoque de minimetagenómica. Para limitar la contaminación por ADN extraño, los reactivos, los tubos y el PBS se trataron con 11,4 J cm-2 de luz ultravioleta siguiendo las pautas de la ref. 72. Las RBS-A se visualizaron utilizando un microscopio invertido Olympus IX70 (Olympus, Waltham, EE. UU.) con un objetivo de 40X y óptica de modulación Hoffman. Se utilizó un micromanipulador Eppendorf TransferMan (Eppendorf, Hamburgo, Alemania, n.º de catálogo 5193000020) con un microinyector SAS-10 para capturar RBS-A con micropipetas de biopsia corporal Polar (en ángulo de 30°, biseladas y pulidas con un diámetro interior de 13– 15 µm) (Cooper Surgical, Målov, Dinamarca, Cat. #MPB-BP-30). Después de adquirir una RBS-A o una cadena de RBS-A, la punta de la micropipeta se transfirió a un tubo de recolección que contenía 1X PBS y se trituró en el tubo para garantizar que las RBS-A se depositaran en el tubo; Se adoptó esta precaución porque los RBS-A con frecuencia se pegaban a la micropipeta de vidrio y no se podían desalojar. No se capturaron células de delfín, aunque es probable que se adquirieran ADN libre de células y células pequeñas no objetivo de la muestra como contaminantes junto con RBS-A, debido a la propensión de estas últimas a unirse a otras especies (Fig. 5e). Se recolectaron cuatro tubos de RBS-A (nombres de muestra RBS1-4), junto con cuatro tubos de control negativo (NEG1-4). Los controles negativos consistieron en extracciones de PBS de la misma muestra que no contenía células visibles y, por lo demás, se trataron de manera idéntica a las muestras que contenían RBS-A.

El ADN de cada tubo se amplificó mediante MDA utilizando el kit unicelular Repli-g (Qiagen, Hilden, Alemania, n.º de catálogo 150343) según el protocolo del fabricante. El ADN se purificó usando una columna Zymo Clean and Concentrate Spin (Zymo Research Corporation, Irvine, EE. UU., Cat. #D4013) y las bibliotecas se prepararon usando el kit Kapa Hyper Prep (Kapa Biosystems, Wilmington, EE. UU., Cat. #KK8504) en el Centro WM Keck de Genómica Funcional Comparada de la Universidad de Illinois, Urbana-Champaign. Las ocho bibliotecas se secuenciaron utilizando la plataforma Illumina MiSeq 2 × 250 nt P2 V2. Las muestras de RBS-A RBS1, RBS2, NEG1 y NEG2 se combinaron y secuenciaron en un solo carril que produjo 11.371.243 pares de lectura, y las muestras RBS3, RBS4, NEG3 y NEG4 se combinaron y secuenciaron en 1,5 carriles, produciendo colectivamente 19.615.690 pares de lectura. Los adaptadores de secuenciación se eliminaron computacionalmente en el Centro Keck.

Las lecturas de las ocho muestras se ensamblaron conjuntamente utilizando SPAdes v. 3.11.173 con los modos de celda única (–sc) y cuidadoso (–careful) especificados. Se utilizó un total de 61.973.866 pares de lectura para el ensamblaje, lo que dio como resultado 1406 andamios de ≥5 kpb de largo con una longitud total de 17.438.233 pb y un N50 de 14.592 para andamios de ≥5 kpb de largo. Los genes codificadores de proteínas se identificaron utilizando Prodigal v. 2.6.274. La cobertura promedio por andamio se calculó mapeando las lecturas por muestra con el coensamblaje usando bowtie2 v. 2.2.475, usando la función de profundidad samtools v. 1.676 para calcular la cobertura de lectura por base y un script personalizado para calcular el promedio por base. leer la cobertura por andamio.

Se realizó una búsqueda del gen amiC2 en contenedores recuperados del experimento de minimetagenómica consultando la alineación de Pfam PF01520 frente a las secuencias de proteínas de cada genoma, utilizando HMMER suite v. 3.1b277.

Para determinar la identidad taxonómica de las células secuenciadas, empleamos un enfoque de resolución del genoma. La asignación de andamios a contenedores de genoma se realizó utilizando las frecuencias de tetranucleótidos de todos los andamios de ≥5 kpb de largo en ventanas de 5 kpb, como se describe en la ref. 78. Los resultados se calcularon y visualizaron utilizando el software Databionics ESOM Tools v. 1.179, lo que condujo a la reconstrucción de 18 contenedores del genoma (Figura complementaria 3). Para refinar los contenedores, eliminamos los andamios para los cuales <50% de las claves estaban asignadas al contenedor. Los andamios de <5 kbp de largo no se desecharon. La integridad y la contaminación por contenedor se evaluaron utilizando CheckM v. 1.0.780. Para evaluar cuán representativa era la agrupación de los genomas que fueron secuenciados, estimamos el número de genomas procarióticos que se esperaba recuperar buscando en el ensamblaje del metagenoma un conjunto de 16 genes bacterianos de copia única (bSCG) que se supone están presentes en cada genoma en una sola copia81, a saber, las proteínas ribosómicas L2, L3, L4, L5, L6, L14, L15, L16, L18, L22, L24, S3, S8, S10, S17 y S19. Alineaciones para estas proteínas (PF00181, PF00297, PF00573, PF00281, PF00347, PF00238, PF00828, PF00252, PF00861, PF00237, PF17136, PF00189, PF00410, PF00338, PF00 366 y PF00203) se obtuvieron de la base de datos Pfam82 (consultada en marzo de 2019) y consultado en nuestro conjunto de datos utilizando HMMER suite v. 3.1b277. El número medio de cada bSCG fue 10, lo que sugiere que ~10 genomas procarióticos estaban representados en nuestro conjunto de datos de secuenciación. En el caso del genoma de interés de la familia Alcaligenaceae, el gen 16S rRNA se extendió manualmente desde el final de un andamio; Usando bowtie2 v. 2.2.4 nos aseguramos de que las lecturas respaldaran la secuencia final.

La identificación taxonómica de contenedores planteó un desafío ya que los genes de ARNr 16S/18S no se amplificaron/secuenciaron/ensamblaron de manera confiable, y los genomas eran parciales con pocos bSCG filogenéticamente informativos presentes en el conjunto de datos. Por lo tanto, utilizamos BLAST v. 2.2.3083 para consultar todos los genes codificadores de proteínas de cada genoma con la base de datos de proteínas no redundantes del NCBI utilizando un valor e de 10-10 y las asignaciones taxonómicas se realizaron en función de la coincidencia de proteínas más cercana. Las asignaciones taxonómicas del contenedor del genoma se consideraron muy probables si ≥50% de los principales resultados de BLAST se originaron en un solo taxón y se consideraron plausibles si <50% pero ≥33% de los principales resultados de BLAST se originaron en un solo taxón.

Existen numerosos enfoques mediante los cuales se puede evaluar si un contenedor está “presente” en una muestra, cada uno con umbrales en gran medida arbitrarios. Nos centramos en la abundancia relativa de cada contenedor por muestra (Tabla complementaria 4), ya que representa la longitud de cada contenedor y permite comparaciones entre muestras con diferentes números de pares de lectura16.

Se infirieron filogenias de máxima probabilidad de la familia Alcaligenaceae utilizando el gen 16S rRNA (Figura complementaria 4a) y la proteína ribosómica S3 (Figura complementaria 4b) para confirmar la afiliación taxonómica del contenedor 16, que se recuperó del experimento de minimetagenómica. Se adquirieron secuencias de genes/proteínas para cada género caracterizado de la familia Alcaligenaceae, como se muestra en el Explorador de taxonomía del NCBI (consultado en agosto de 2022), cuando dichas secuencias estaban disponibles en el sistema NCBI (algunos géneros tienen escasa o ninguna representación genómica). Además, realizamos consultas BLAST83 v. 2.2.30 del gen bin 16 16S rRNA y la proteína rpS3 en las bases de datos nr/nt y nr (consultada en agosto de 2022), respectivamente, e incluimos las 10 secuencias más similares. Las secuencias del gen 16S rRNA se alinearon utilizando SINA84 v. 1.2.11, utilizando la base de datos SILVA SSU versión 138.1 como referencia, y se eliminaron las columnas que contenían >3 % de espacios o filas con <50 % de secuencia. Las secuencias de la proteína rpS3 se alinearon utilizando Clustal Omega85,86 v. 1.2.4 y se eliminaron las columnas que contenían >5 % de espacios o filas con <50 % de secuencia. Ambas filogenias se infirieron utilizando PhyML87 v. 3.1 con 1000 réplicas de arranque, y la selección del modelo se realizó mediante la selección de modelo inteligente88 (GTR+R para el gen 16S rRNA y Q.yeast+G+I para la proteína rpS3). Los árboles se visualizaron utilizando iTOL89 v.6.

Se seleccionaron cuatro muestras orales de delfines que contenían RBS para los esfuerzos de cultivo. Para cada muestra, se añadió un mililitro de PBS estéril a un tubo Eppendorf de 1,5 ml que contenía la muestra del hisopo oral. Para el cultivo líquido, se utilizaron 600 µL de cada muestra para inocular 3 ml de BSTSY90 (2,75 % (p/v) de caldo de soja tríptico, 0,4 % (p/v) de extracto de levadura, 10 % de suero bovino), SHI91 o medio mSHI. (SHI suplementado con 0,9 g/L de NaCl, 2,5 g/L de K2PO4, 0,84 g/L de NaHCO3, 0,17 g/L de CaCl2, 0,04 g/L de MgCl2·6H2O y 5 g/L de dextrosa). BSTSY fue seleccionado por su uso en el cultivo exitoso de bacterias (específicamente S. muelleri) de las cavidades orales de varios mamíferos90. Se seleccionó SHI porque este medio fue diseñado para sustentar comunidades de alta diversidad derivadas de la microflora oral humana. Se incluyó mSHI (SHI modificado) como una versión de mayor salinidad de SHI en un intento de imitar aún más las condiciones que podrían encontrarse en la cavidad bucal de los delfines. La inoculación se repitió en condiciones anaeróbicas en una cámara anaeróbica (COY Lab Products, Grass Lake, EE. UU.); tenga en cuenta que todas las muestras estuvieron inevitablemente expuestas al oxígeno atmosférico antes del cultivo. Los cultivos se incubaron a 37 °C para imitar la temperatura corporal de los delfines. No se detectaron RBS en medios líquidos mediante examen visual bajo un microscopio después de ~24, ~48, ~72 y ~96 h. Para el cultivo de superficie sólida, se sembraron ~103-104 células (verificadas por microscopía que contenían RBS-A) directamente en placas de agar BSTSY o sangre BHI (medio BHI suplementado con sangre de oveja al 5%) y se incubaron a 37 °C con o sin oxígeno, respectivamente. No crecieron colonias en las placas BSTSY después de 3 semanas de incubación; Las colonias cultivadas en las placas de sangre BHI se examinaron mediante microscopía y no se observaron RBS. Por el contrario, un control de S. muelleri sembrado en placas BSTSY desarrolló colonias visibles después de 1 a 2 días de incubación con oxígeno a 37 °C, y se verificó bajo microscopía que las colonias consistían en células con la morfología esperada de S. muelleri.

Dada la naturaleza exploratoria de este estudio descriptivo, la mayoría de los experimentos para caracterizar las RBS se realizaron una sola vez.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación para este proyecto están disponibles a través de NCBI BioProject PRJNA174530. Las lecturas sin procesar para el estudio de amplicones se depositaron en SRA y están asociadas con BioSamples SAMN32739817-69 y SAMN19012476. Los datos del experimento de aumento están asociados con BioSamples SAMN32869723-5. Las lecturas sin procesar para el experimento de genómica unicelular también se depositaron en la SRA; las RBS capturadas y los controles negativos se derivaron físicamente de un único hisopo oral representado por BioSample SAMN19012476, mientras que las lecturas de las ocho réplicas experimentales (cuatro RBS, cuatro controles negativos) están asociadas individualmente con BioSamples SAMN19022663-SAMN19022670. El coensamblaje de andamios de ≥5 kb de longitud del experimento de genómica unicelular se depositó como un proyecto Whole Genome Shotgun en DDBJ/ENA/GenBank bajo el número de acceso JAHCSF000000000, luego de la eliminación de secuencias derivadas de humanos. La versión descrita en este documento es JAHCSF010000000. Los contenedores de genoma 2–5 y 7–18 del experimento de genómica unicelular se han depositado como un proyecto Whole Genome Shotgun en DDBJ/ENA/GenBank bajo las accesos JAGYHI000000000-JAGYHX000000000. Las versiones descritas en este documento son JAGYHI010000000-JAGYHX010000000. El genoma bin 1 (humano) no fue depositado. Los andamios para el genoma bin6 (<100.000 nucleótidos) se depositaron como una presentación de GenBank sin genoma con los números de acceso MZ126582-MZ126593. Los conjuntos de datos y bases de datos públicos utilizados en este estudio son los siguientes: la versión 138.1 de la base de datos SILVA SSU se utilizó como referencia para asignar identidades taxonómicas a los ASV. Se utilizaron las bases de datos NCBI nr/nt, nr y taxonomía (consultadas en agosto de 2022) para obtener secuencias del gen 16S rRNA (n = 77) y secuencias de la proteína ribosómica S3 (n = 63) para representantes de géneros de la familia Alcaligenaceae. Los números de acceso del NCBI para estas secuencias están disponibles en las figuras complementarias. 4 y 5, respectivamente. Finalmente, realizamos análisis con alineaciones obtenidas de la base de datos Pfam82. La alineación de Pfam PF01520 se utilizó para buscar en contenedores del genoma proteínas AmiC2 (consultado en agosto de 2022). Se utilizaron las siguientes alineaciones de Pfam para buscar 16 genes bacterianos de copia única (consultado en marzo de 2019): PF00181, PF00297, PF00573, PF00281, PF00347, PF00238, PF00828, PF00252, PF00861, PF00237, PF17136, PF00. 189, PF00410, PF00338, PF00366 y PF00203.

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Agradecemos a los miembros del laboratorio Relman por sus interesantes debates, a Katharine Ng y Brian Yu por su ayuda en los intentos de capturar RBS-A mediante microdisección por captura láser y microfluidos, respectivamente, a Melissa Clark por su ayuda con la tinción de Gram, a Michael Schmid por el análisis de la superficie periódica. cubriendo sobre RBS-A, y especialmente Celeste Parry y colegas del Programa de Mamíferos Marinos de la Marina de los EE. UU. en San Diego, CA, para recolectar muestras orales de delfines. Este trabajo fue apoyado por la subvención P41GM103832 (WC) de los NIH, una beca posdoctoral James S. McDonnell (HS), el Fondo Austriaco para la Ciencia (TV, SB) y el Fondo Thomas C. y Joan M. Merigan de la Universidad de Stanford (DAR). . KCH y DAR son investigadores de Chan Zuckerberg Biohub.

Natasha K. Dudek

Dirección actual: Quantori, Cambridge, MA, 02142, EE. UU.

Megan Mayer

Dirección actual: Departamento de Química Biológica y Farmacología Molecular, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, 02115, EE. UU.

Departamento de Medicina, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, 94305, EE. UU.

Natasha K. Dudek y David A. Relman

Departamento de Ecología y Biología Evolutiva, Universidad de California, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, 95064, EE. UU.

Natasha K. Dudek

Departamento de Bioingeniería, Universidad de Stanford, Stanford, CA, 94305, EE. UU.

Jesús G. Galaz-Montoya, Handuo Shi, Cristina Danita, Gong-Her Wu, Kerwyn Casey Huang y Wah Chiu

Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, 94305, EE. UU.

Handuo Shi, Arianna I. Celis, Kerwyn Casey Huang, Wah Chiu y David A. Relman

División de CryoEM y Bioimagen, SSRL, Laboratorio Nacional del Acelerador SLAC, Menlo Park, CA, 94025, EE. UU.

Megan Mayer y Wah Chiu

Departamento de Ecología Funcional y Evolutiva, Grupo de Biología Celular Ambiental, Universidad de Viena, Viena, Austria

Tobias Viehboeck y Silvia Bulgheresi

División de Ecología Microbiana, Centro de Microbiología y Ciencia de Sistemas Ambientales y Escuela de Doctorado en Ecología y Evolución de Viena, Universidad de Viena, Viena, Austria

Tobias Viehboeck

Departamento de Obstetricia y Ginecología, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, 94305, EE. UU.

Barry Behr

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, CA, 94158, EE. UU.

Kerwyn Casey Huang y David A. Relman

Sección de Enfermedades Infecciosas, Asuntos de Veteranos Palo Alto Health Care System, Palo Alto, CA, 94304, EE. UU.

David A. Relman

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Conceptualización: NKD, KCH, DAR Metodología e investigación: NKD, JGG-M., HS, MM, CD, AIC, G.-HW, TV, SB, BB, KCH, WC, DAR Análisis formal: NKD, JGG-M ., HS, CD Visualización: NKD, JGG-M., HS, CD Escritura—borrador original: el manuscrito fue escrito principalmente por NKD y JGG-M. Basado en el borrador original de NKD, con revisiones de todos los demás autores. Escritura: revisión y edición: todos los autores. Supervisión: KCH, WC, DAR

Correspondencia a David A. Relman.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Brian Hedlund y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Dudek, NK, Galaz-Montoya, JG, Shi, H. et al. Estructuras bacterianas rectangulares previamente no caracterizadas en la boca del delfín. Nat Comuna 14, 2098 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37638-y

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Recibido: 01 de noviembre de 2021

Aceptado: 23 de marzo de 2023

Publicado: 13 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37638-y

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