Células senescentes RANKL+ bajo estrés mecánico: un objetivo terapéutico para la reabsorción radicular de ortodoncia utilizando senolíticos

Revista Internacional de Ciencias Orales volumen 15, número de artículo: 20 (2023) Citar este artículo

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En odontología, la reabsorción radicular ortodóncica es un problema duradero sin una estrategia de tratamiento eficaz, y sus mecanismos, especialmente los relacionados con las células senescentes, siguen siendo en gran medida desconocidos. Aquí, utilizamos un modelo de movimiento dental de intrusión ortodóncica con un asa en L en ratas para demostrar que las células senescentes inducidas por estrés mecánico agravan la reabsorción de la raíz apical, lo que se evitó mediante la administración de senolíticos (un cóctel de dasatinib y quercetina). Nuestros resultados indicaron que los cementoblastos y las células del ligamento periodontal experimentaron senescencia celular (p21+ o p16+) y expresaron fuertemente el activador del receptor del factor nuclear kappa B (RANKL) desde el tercer día, induciendo posteriormente odontoclastos positivos a la fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) y provocando reabsorción de la raíz apical. Más células senescentes p21+ expresaron RANKL que células senescentes p16+. Observamos solo cambios menores en el número de células no senescentes RANKL+, mientras que las células senescentes RANKL+ aumentaron notablemente desde el día siete. Curiosamente, también encontramos células de catepsina K+p21+p16+ en la fosa de reabsorción de la raíz, lo que sugiere odontoclastos senescentes. La administración oral de dasatinib y quercetina redujo notablemente estas células senescentes y las células TRAP+, aliviando finalmente la resorción radicular. En conjunto, estos resultados revelan esos estímulos aberrantes en el movimiento dental intrusivo ortodóncico inducido por células senescentes tempranas RANKL+, que tienen un papel fundamental en la odontoclastogénesis y la posterior resorción radicular. Estos hallazgos ofrecen un nuevo objetivo terapéutico para prevenir la reabsorción radicular durante el movimiento dental ortodóncico.

La reabsorción de la raíz apical durante el tratamiento de ortodoncia comúnmente afecta a los ortodoncistas. Por ejemplo, en algunos estudios previos, las tasas de incidencia de reabsorción radicular se alcanzaron en 90% y 100%.1 Además, la reabsorción radicular apical de moderada a severa ocurre en 12% a 17% de los pacientes de ortodoncia, provocando ocasionalmente efectos secundarios clínicos no deseados. , pérdida de dientes.2 Sin embargo, actualmente no existen terapias preventivas efectivas. Por tanto, es necesario explorar dianas terapéuticas veladas basadas en mecanismos novedosos.

La resorción radicular es un mecanismo complejo que subyace a una orquesta de activación celular no fisiológica y movilización de numerosas células.3 De manera similar a los osteoclastos asociados con la resorción ósea, los odontoclastos emergen para reabsorber las superficies radiculares.4,5 El activador del receptor del factor nuclear kappa B ligando (RANKL)/vía relacionada con RANK es una de las vías clásicas que promueve vigorosamente la inducción y activación de odontoclastos y osteoclastogénesis.3 Varios tipos de células, como los cementoblastos y las células del ligamento periodontal (PDL), expresan este ligando.6,7 Además, múltiples factores estresantes facilitan la expresión de RANKL, incluida la inflamación, las especies reactivas de oxígeno (ROS) y el estrés mecánico no fisiológico.8,9 Por ejemplo, una línea celular de cementoblasto humana inmortalizada y células PDL expresan significativamente RANKL bajo estrés;10,11 ,12,13,14 El movimiento dental ortodóncico (OTM) activa los cementoblastos para inducir la expresión de RANKL.15,16 Por lo tanto, considerando las similitudes entre la osteoclastogénesis y la odontoclastogénesis,17 los fármacos para la osteoporosis (p. ej., bisfosfato, que causa la muerte celular directa, y denosumab, un anticuerpo anti-RANKL que previene la formación de osteoclastos) se han investigado exclusivamente para tratar la reabsorción radicular.18,19 Sin embargo, hasta el momento, estos fármacos aún no han alcanzado aplicación clínica.

La senescencia celular es inevitable para las células envejecidas, lo que resulta en una detención irreversible de la proliferación, fuertes señales mitogénicas, telómeros acortados, daño al ADN y aumento de ROS in vitro e in vivo.20,21 En particular, el daño al ADN juega un papel crucial en la enfermedad prematura inducida por estrés. senescencia, provocada por diversos factores estresantes, como agentes mecánicos, oxidativos, de radiación y genotóxicos.22,23,24,25 Incluso en odontología, se ha informado senescencia celular inducida por etanol en cementoblastos y células del ligamento periodontal.26 Otros investigadores también han demostraron que los cementoblastos sufren senescencia celular e inhibición de la calcificación en respuesta a estímulos de estrés mecánico.27 Las células senescentes generalmente activan cascadas de factores de transcripción, como p53/p21CIP1, una vía implicada en la represión del ciclo celular, y p16INK4A/RB.28,29 Por lo tanto, p21 y p16 son marcadores bien utilizados para detectar células senescentes.30,31 Además, los rápidos avances en los estudios de senescencia celular han revelado que las células senescentes están implicadas en diversas enfermedades relacionadas con la edad e influyen en la esperanza de vida al secretar fenotipos secretores asociados a la senescencia, incluidas sustancias inflamatorias.32 que dañan los tejidos circundantes.33

En 2015, se identificó un cóctel de medicamentos compuesto por dasatinib (inhibidor de la tirosina quinasa; utilizado para tratar la leucemia mieloide crónica) y quercetina (un flavonoide de origen vegetal) como un agente inductor de muerte celular específico (es decir, un senolítico) para las células senescentes. (en adelante dasatinib y quercetina [D + Q])34. Desde entonces, se ha confirmado su eficacia en diversas enfermedades, como la diabetes, la enfermedad de Alzheimer35 y la osteoporosis36, y para restablecer la regeneración ósea37. Los ensayos de viabilidad clínica y el desarrollo de otros senolíticos están progresando continuamente.38,39 En consecuencia, las células senescentes ahora se reconocen como objetivos terapéuticos para diversas enfermedades.20 Por lo tanto, las células senescentes son un objetivo terapéutico potencial para prevenir la resorción radicular. Sin embargo, se sabe poco sobre la asociación y localización de células senescentes bajo OTM y su función en la resorción radicular.

Aquí, mostramos que el estrés mecánico nocivo por OTM induce cementoblastos senescentes RANKL positivos (RANKL+) y células PDL, exacerbando la resorción radicular en molares de rata utilizando un modelo de movimiento dental intrusivo de ortodoncia con un bucle en L. Además, verificamos que la administración oral de D + Q redujo notablemente el número de células senescentes RANKL+, atenuando la resorción radicular, lo que indica que las células senescentes inducidas por estrés mecánico son un objetivo potencial para la terapia de resorción radicular.

Para imitar la reabsorción de la raíz apical, primero establecimos un modelo OTM de rata con un bucle en L verticalmente hacia abajo que se muestra en las Figs. 1a, b. Un L-loop es un aparato convencional utilizado en el tratamiento de ortodoncia que genera las fuerzas y momentos deseados para mover los dientes de manera predecible. En consecuencia, la fuerza se propaga directamente al ápice y al tejido del PDL como tensión mecánica. Los primeros molares superiores izquierdos (M1) se sometieron a una fuerza mecánica (5 N) aplicada verticalmente hacia abajo de forma continua durante 14 días (Fig. 1c, d). Se utilizaron ratas sin tratamiento con bucle en L como grupo de control (Fig. 1c, Fig. S1). El análisis de tomografía microcomputarizada (μ-CT) no mostró movimiento dental en el grupo de control después de 14 días (Fig. S1a), mientras que los M1 se movieron significativamente verticalmente hacia abajo después del día 5 con el asa L, lo que indica que OTM causó con éxito fuerza mecánica y tensión en los tejidos periapicales (Fig. 1d, e).

El modelo de intrusión dental de ortodoncia en ratas. a Un diagrama esquemático del sistema de fuerza del bucle en L en el modelo de movimiento dental de ortodoncia (OTM). Líneas azules horizontales: patas en forma de L en la etapa inactivada. Después de agregar fuerza vertical (5 N: flecha roja) a las patas del bucle en L usando resina, el M1 izquierdo se somete a la fuerza vertical (flecha verde) mediante efectos de palanca (círculos rojos). M1: primer molar, M2: segundo molar, M3: tercer molar. b Imágenes macroscópicas del modelo con el asa en L desde el lado bucal (izquierda) y frontal (aumentos bajos y altos: imágenes media y derecha, respectivamente). c Un diagrama de flujo de un experimento con animales (n = 4 por grupo). D dasatinib, Q quercetina. d Imágenes reconstruidas de tomografía microcomputarizada (μ-CT) de los molares superiores izquierdos. Líneas blancas: la línea de base para medir la distancia OTM de M1. Flecha amarilla de dos direcciones: la distancia desde la cúspide de M1 hasta la línea básica. e Un análisis cuantitativo de la distancia OTM desde (d), representado como medias ± desviaciones estándar. ****P < 0,000·1; ns no significativo

Posteriormente, para investigar si el modelo OTM podría causar reabsorción radicular, evaluamos el ápice de la raíz mesial de M1 utilizando µ-CT y tinción histológica, incluida la tinción con fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) para la detección de odontoclastos. Las imágenes de μ-CT de alta resolución y de reconstrucción tridimensional (3D) revelaron que la morfología de la superficie de la raíz apical cambiaba de manera dependiente del tiempo, volviéndose irregular bajo estrés (Fig. 2a). Además, el análisis cuantitativo µ-CT mostró que la densidad mineral de la raíz apical (RMD) media disminuyó significativamente desde el día 5 de estrés (Fig. 2c). La tinción TRAP no identificó odontoclastos (es decir, células TRAP+) en el grupo de control (Fig. S1b). Sin embargo, en el grupo OTM, aparecieron odontoclastos en la superficie de la raíz desde el día 3 de estrés, aunque los números fueron pocos (Fig. 2b, flechas negras). Por el contrario, aparecieron más osteoclastos (células TRAP+: Fig. 2b, e, puntas de flecha negras) en la superficie del hueso alveolar desde el día 3 de estrés. Los odontoclastos aumentaron rápidamente desde el día 5 de estrés, coincidiendo con el inicio de la resorción radicular (Fig. 2b, d). ). Las imágenes de tinción con hematoxilina-eosina (HE) indicaron que se produjo una reabsorción radicular severa en el ápice desde los días de estrés 7 a 14 (Fig. 2b, puntas de flecha blancas).

Resorción radicular apical en dientes de ratas sometidas a estrés mecánico. una μ-CT e imágenes de reconstrucción tridimensional del ápice de la raíz mesial del primer molar superior izquierdo. b Imágenes de la raíz mesial de fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) y tinción con hematoxilina-eosina después de aplicar tensión mecánica. Flechas negras: células odontoclastas TRAP+. Puntas de flecha negras: osteoclastos TRAP+. Hueso alveolar ab. Puntas de flecha blancas: fosa de reabsorción radicular. c Densidad mineral radicular (RMD) del ápice radicular mesial. d Números de odontoclastos TRAP+ en las superficies radiculares. e Número de osteoclastos TRAP+ en la superficie del hueso alveolar. Los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar. **P < 0,01, ***P < 0,001, ns no significativo. Barras de escala: 100 μm para (a) y 250 μm para (b). Sin número

La estimulación por estrés mecánico induce la senescencia celular de los cementoblastos y las células PDL26,27 y regula positivamente la expresión de RANKL,40,41,42, lo que está potencialmente asociado con la resorción radicular. Por lo tanto, verificamos la localización de las células positivas para la proteína de unión al cemento (CAP) que expresan marcadores de senescencia (p21 y p16) y RANKL mediante tinción por inmunofluorescencia (Figs. 3a, 4a y S2a). Además, utilizando Ki-67 (un marcador de proliferación bien conocido) y tinción TUNEL (utilizable para la detección de daños en el ADN y apoptosis), confirmamos la senescencia celular y los daños en el ADN (Figs. S3 y S4). Los cementoblastos y las células PDL secretan CAP; por lo tanto, se utilizó CAP para identificarlas.43,44,45,46 De ahora en adelante, definimos las células CAP+ en la superficie de la raíz como cementoblastos y las células CAP+ en PDL como células PDL.

Células RANKL+ y células senescentes p21+ en tejidos periapicales bajo estrés mecánico. a Tinción de inmunofluorescencia y colocalización de la proteína de unión al cemento (CAP) y el activador del receptor del ligando del factor nuclear kappa-Β (RANKL) con p21 bajo la contratinción de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en tejidos periapicales después aplicando tensión mecánica. Núcleo: azul (DAPI); GORRA: verde; RANKL: blanco; p21: rojo. Barras de escala: 100 y 25 μm para aumento bajo y alto, respectivamente. Las flechas blancas y la línea discontinua naranja en (a) indican el área de la fosa de reabsorción radicular. Ligamento periodontal PDL. a1 Células reactivas a la fluorescencia en la fosa de reabsorción radicular. Barra de escala: 10 μm

Células RANKL+ y células senescentes p16+ en tejidos periapicales bajo estrés mecánico. a Tinción de inmunofluorescencia y colocalización de la proteína de unión al cemento (CAP) y RANKL con p16 bajo la contratinción DAPI en tejidos periapicales después de aplicar tensión mecánica. Núcleo: azul (DAPI); GORRA: verde; RANKL: blanco; p16: rojo. Barras de escala: 100 y 25 μm para aumento bajo y alto, respectivamente. Las flechas blancas y la línea discontinua naranja en (a) indican el área de la fosa de reabsorción radicular. Ligamento periodontal PDL. a1 Células reactivas a la fluorescencia en la fosa de reabsorción radicular. Barra de escala: 10 μm

Las Figuras 3 a 5, Figuras S1c y S2a muestran las distribuciones espaciotemporales de las células que expresan CAP, RANKL, p21 o p16 en los tejidos periapicales y los números cuantificados. En el grupo de control, no se observaron cementoblastos y células PDL que expresaban RANKL o p21 después de 14 días sin OTM (Fig. S1c). Por el contrario, las células RANKL+, p21+ y p16+ aparecieron en los tejidos periapicales bajo estrés mecánico (Figs. 3, 4 y Fig. S2a). El número de células proliferativas disminuyó en paralelo al aumento de los marcadores p21 (Fig. S3), mientras que las células dañadas en el ADN (células TUNEL+) aumentaron (Fig. S4) bajo el estrés mecánico. Los cementoblastos RANKL+ y las células RANKL+ PDL (es decir, RANKL+CAP+) aparecieron a partir del día 3 de estrés y aumentaron notablemente en los días 5 y 7 de estrés (Fig. 5a). De manera similar, los cementoblastos senescentes y las células PDL (células p21 + CAP + o p16 + CAP +) aumentaron desde los días 3 a 7 de estrés (Fig. 5b, c). Aunque no pudimos comparar directamente los números absolutos de células p21+ y p16+ debido a las diferentes secciones, podemos concluir que el número de células p21+ aumentó antes que las células p16+ dada la diferencia estadística por sección. Entre estas células senescentes, encontramos cementoblastos RANKL+ y células PDL en los tejidos periapicales (Figs. 3 y 4). Las Figuras 3a1 y 4a1 presentan cementoblastos senescentes RANKL+ representativos en la fosa de reabsorción radicular.

Se analizó la proporción de cementoblastos y PDL senescentes (p21+ o p16+) o RANKL+ en tejidos periapicales. a El número de cementoblastos RANKL+ o células RANKL+ PDL en los tejidos periapicales. Cementoblastos: células CAP+ en la superficie de la raíz; Células PDL: células CAP+ en PDL. b, c El número de cementoblastos p21+ o p16+ o células PDL en los tejidos periapicales. Los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,000 1, ns no significativo. Sin número

Para analizar el carácter de los cementoblastos o células PDL (células CAP+) bajo estrés mecánico, clasificamos además cada célula según la expresión del marcador senescente (p21 y p16) y RANKL (Figs. 6 y 7 para cementoblastos y células PDL, respectivamente). En los cementoblastos senescentes (p21+ o p16+; círculos rojos rotos en las Fig. 6a-c), las células RANKL+ aumentaron con el tiempo hasta el día 7 de estrés, mientras que las células RANKL– solo tuvieron cambios menores (Fig. 6b, c); Estos resultados sugieren que la mayoría de los cementoblastos senescentes expresaron RANKL. Mientras tanto, en las células PDL senescentes (p21+ o p16+; círculos rojos discontinuos en las figuras 7a-c), las células senescentes RANKL+ y RANKL– aumentaron de manera similar hasta el día 7 de estrés. Aunque no pudimos dilucidar las razones de las diferencias anteriores, estos resultados demuestran que los cementoblastos senescentes y las células PDL expresan sensiblemente RANKL en respuesta al estrés mecánico en el tejido periapical.

Clasificación de RANKL+ o cementoblastos senescentes en tejidos periapicales bajo movimiento dental ortodóncico (es decir, estrés mecánico). a Diagramas esquemáticos de RANKL+ o cementoblastos senescentes bajo tensión mecánica. Círculos rojos discontinuos: células senescentes que expresan o no RANKL de (b) y (c). Círculos discontinuos azules: células RANKL+ que expresan o no marcadores senescentes (p21 o p16) de (d) y (e). b, c Expresión de RANKL en cementoblastos senescentes (p21+/CAP+/DAPI o p16+/CAP+/DAPI). d, e Expresión del marcador senescente (p21 o p16) en cementoblastos RANKL+ (RANKL+/CAP+/DAPI). Los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,000 1, ns no significativo. Sin número

Clasificación de células RANKL+ o PDL senescentes en tejidos periapicales bajo movimiento dental ortodóncico (es decir, estrés mecánico). a Diagramas esquemáticos de células RANKL+ o PDL senescentes bajo tensión mecánica. Círculos rojos discontinuos: células senescentes que expresan o no RANKL de (b) y (c). Círculos discontinuos azules: células RANKL+ que expresan o no marcadores senescentes (p21 o p16) de (d) y (e). b, c Expresión de RANKL en células PDL senescentes (p21+/CAP+/DAPI o p16+/CAP+/DAPI). d, e Expresión del marcador senescente (p21 o p16) en células RANKL+ PDL (RANKL+/CAP+/DAPI). Los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar. **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,000 1, ns no significativo. Sin número

A continuación, analizamos la proporción de células senescentes (p21+ o p16+) en cementoblastos RANKL+ (círculos azules discontinuos en la Fig. 6a, d, e). El número de células p21– y p21+ no difirió hasta el día 5 de estrés, luego las células p21+ aumentaron notablemente desde el día 7 de estrés (Fig. 6d). Mientras tanto, el número de células p16+ fue consistentemente menor que el número de células p16– hasta el día 14 de estrés. Es de destacar que las células p21– representan células no senescentes porque p21 es un conocido productor de senescencia temprana.47 Sin embargo, las células p16– son no siempre células no senescentes porque también incluyen células senescentes tempranas p21+; Las expresiones de p21 y p16 se superponen en la senescencia tardía.47 La propensión de las células PDL senescentes bajo estrés mecánico es consistente con el resultado de los cementoblastos senescentes (Fig. 7d, e). En conjunto, RANKL se expresó principalmente en células senescentes p21+ en lugar de células no senescentes y células p16+.

Para probar si el odontoclasto experimentó senescencia celular, teñimos las secciones de tejidos periapicales usando un anticuerpo para un marcador de odontoclasto (catepsina K) con marcadores senescentes (p21 y p16). Curiosamente, encontramos células multinucleares de catepsina K + p21 + p16 + en la fosa de resorción de la raíz (Fig. 8 y S2b), pero no en grupos libres de estrés el día 14 (Fig. S5).

Odontoclastos senescentes en la fosa de reabsorción radicular. Imágenes de inmunofluorescencia de los sitios de reabsorción radicular teñidas con catepsina K, p21, p16 y DAPI después de 14 días de estrés mecánico. Núcleo: azul (DAPI); catepsina K: blanco; p21: rojo; p16: verde. Barra de escala = 100 μm y 25 μm para aumento bajo y alto, respectivamente. Las flechas blancas y la línea discontinua naranja indican el área de reabsorción radicular. hueso alveolar abdominal

Para aclarar la función de los cementoblastos senescentes RANKL + y las células PDL para la resorción de la raíz del diente, administramos por vía oral un senolítico (D + Q) a las ratas bajo estrés mecánico los días 1 y 7 (Fig. 1c). La dosis senolítica se definió a partir de estudios previos.48 El número de células senescentes RANKL+ (p21+ o p16+) y células de catepsina K+p21+p16+ disminuyó significativamente en el grupo D + Q (Figs. 9a, by S6) desde la superficie de la raíz; se restableció el número de células Ki67+ (células de proliferación), mientras que las células TUNEL+ (células apoptóticas) aumentaron (Figs. S3 y S4). El número total de cementoblastos y células PDL también disminuyó en los tejidos periapicales (Fig. 9c). Además, las células TRAP+ y las células multinucleares de catepsina K+p21+p16+ disminuyeron significativamente desde la superficie de la raíz (Figs. 9d, f y S6). Sin embargo, todavía identificamos células TRAP+ y catepsina K+ (pero no p21+p16+) en el hueso alveolar (Figs. 9d y S6) a pesar de que las células senescentes disminuyeron (Fig. S6) y en algunas partes estaban co-localizadas. cerca de los osteoclastos bajo la tensión mecánica (Fig. S7). Las imágenes µ-CT de alta resolución con reconstrucción 3D y análisis cuantitativos determinaron que las raíces tenían una superficie más lisa con la administración de D + Q que sin D + Q. El RMD de la porción apical proximal fue mayor en el grupo D + Q que en el grupo grupo sin D + Q (Fig. 9e, f). El movimiento de los dientes después de la administración de D + Q disminuyó a aproximadamente el 50% (Fig. 10). El resultado indica que la administración oral de senolíticos atenuó efectivamente la resorción radicular que ocurre bajo estrés mecánico al eliminar las células senescentes RANKL+ (Fig. 11), mientras que se requiere una elucidación más detallada y una mejora cautelosa para avanzar en esta terapia para uso clínico.

La administración oral de senolíticos evitó la resorción radicular. Las ratas fueron tratadas con dasatinib (D) + quercetina (Q) o se dejaron sin tratamiento los días 1 y 7 durante el movimiento dental ortodóncico (es decir, estrés mecánico) durante 14 días. a Imágenes de inmunofluorescencia de los tejidos periapicales teñidos con CAP, RANKL, p21, p16 y DAPI. Núcleo: azul (DAPI), RANKL: blanco; GORRA: verde; p21 o p16: rojo. Barra de escala = 100 μm y 25 μm para aumento bajo y alto, respectivamente. b El número de cementoblastos RANKL+p21+ y células PDL o cementoblastos RANKL+p16+ y células PDL en los tejidos periapicales. c Cementoblastos y células PDL (células CAP+) en los tejidos periapicales. d Tinción TRAP e imágenes μ-CT del ápice de la raíz mesial. Barras de escala: 100 μm para imágenes μ-CT y 250 μm para tinción TRAP. e Imágenes de reconstrucción tridimensional del ápice de la raíz mesial del primer molar superior izquierdo. f El número de células TRAP+ en los ápices y la densidad mineral radicular (RMD) de los ápices radiculares mesiales. Los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar. *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,000 1. Sin número

Movimiento dental con o sin administración de D + Q el día 14. Las ratas fueron tratadas con D + Q o sin tratamiento los días 1 y 7 durante el movimiento dental ortodóncico (es decir, estrés mecánico) durante 14 días (Fig. 1c). a Imágenes μ-CT reconstruidas de los molares superiores izquierdos. Líneas blancas: la línea de base para medir la distancia OTM de M1. Flecha amarilla de dos direcciones: la distancia desde la cúspide de M1 hasta la línea básica. Barra de escala: 1 mm. b Un análisis cuantitativo de la distancia OTM. Los datos se representan como medias ± desviaciones estándar. ****P < 0,000 1

Diagrama esquemático que ilustra la prevención de la reabsorción radicular utilizando dasatinib y quercetina después de movimientos dentales ortodóncicos.

Encontramos células senescentes RANKL+ y odontoclastos TRAP+ alrededor de la raíz apical con OTM. La administración oral repetida de D + Q disminuyó el número de esas células y atenuó notablemente la resorción radicular. Estos resultados indican que la senescencia inducida por estrés mecánico juega un papel crucial en la resorción radicular, que se puede prevenir con senolíticos.

En este estudio, indujimos con éxito fuerzas verticales y tensión mecánica en los M1 del maxilar izquierdo de ratas utilizando un bucle en L (Fig. 1). Los OTM se han imitado en numerosos estudios con varios modelos experimentales, como modelos de movimiento horizontal de los dientes que utilizan cadenas elásticas,49 resortes helicoidales cerrados,50 y aparatos de tipo cuádruple hélice,51 entre otros.52 Sin embargo, estos modelos experimentales han inducido principalmente movimiento horizontal de los dientes. Mientras tanto, sólo unos pocos estudios han intentado desarrollar un modelo de movimiento dental de intrusión para inducir la reabsorción radicular en las puntas de las raíces,52,53 a pesar de que los tratamientos de ortodoncia a menudo utilizan el movimiento dental vertical que genera fuerza de intrusión. En el movimiento vertical de los dientes, la raíz apical y los tejidos periodontales sufren un alto estrés mecánico, lo que eleva el riesgo de reabsorción radicular54,55 Después de la reabsorción radicular temporal y la posterior restauración con cemento,56 la punta de la raíz se aplana gradualmente y no recupera por completo su longitud.57 Como resultado, hay más gravedad en la reabsorción de la raíz apical que en la resorción de la raíz lateral.58 En consecuencia, preparamos un modelo de movimiento dentario por intrusión que demostró ser una plataforma valiosa para dilucidar los mecanismos subyacentes a la reabsorción de la raíz apical. Nuestro modelo preparado sólo necesita alambre de acero inoxidable y es fácil colocar los bucles en los dientes. Mientras tanto, la preparación de la forma del asa en L requiere habilidades de ortodoncia.

Nuestros análisis histológicos y µ-CT mostraron que la reabsorción de la raíz apical severa comenzó alrededor del día 5 de estrés (Fig. 2a, b). Curiosamente, la resorción de la raíz apical se retrasó con respecto a la resorción ósea con OTM (Fig. 2a). Además, comenzaron a aparecer más osteoclastos TRAP+ que odontoclastos TRAP+ en el hueso alveolar en el día 3 de estrés (Fig. 2b, d, e). Aunque varios investigadores han estudiado odontoclastos y osteoclastos in vivo e in vitro,59 la diferencia en la formación de esos dos tipos de células in vivo sigue sin estar del todo clara. Estudios previos han informado que los cementoblastos estimulados mecánicamente expresan menos RANKL que los osteoblastos,10 y la susceptibilidad a la estimulación mecánica difiere en los cementoblastos y los osteocitos.60 Además, la distancia desde la médula ósea, donde estarían los monocitos (el origen de los odontoclastos y los osteoclastos), podría estar parcialmente asociado con el desfase entre la resorción de la raíz apical y la resorción ósea.

Aunque p21 y p16 son marcadores importantes relacionados con la senescencia, su cinética de expresión difiere61. En nuestro estudio, las células p21+ aparecieron antes que las células p16+ en los tejidos periapicales sometidos a estrés mecánico vertical (Figs. 3, 4 y 5). Estudios anteriores han informado que los incrementos de la expresión de p21 disminuyeron drásticamente al alcanzar la senescencia celular, mientras que la de p16 continuó durante un período y luego aumentó al final de la vida celular y al comienzo de la diferenciación.47 Por lo tanto, algunos han propuesto recientemente que p21 es un marcador de senescencia temprana y p16 es un marcador de senescencia tardía.47 Además, informes más recientes indican que los cementoblastos estimulados por estrés mecánico expresan lincRNA-p21,27 un factor crítico que regula la apoptosis y la proliferación celular al reprimir la traducción de genes diana a través de la Vía de señalización de p5362 (la vía principal que regula la expresión de p2161). Dado que p21 se expresó consistentemente más que p16 desde el día 3 en nuestro estudio, nuestros datos proporcionan evidencia de que el estrés mecánico inducido por OTM también produce células senescentes en el orden de p21 a p16, incluso in vivo (Fig. 5).

Estudios previos han demostrado que los cementoblastos y las células PDL producen potencialmente RANKL bajo estímulos de estrés mecánico in vitro.12,16 La alta expresión de RANKL promueve la conversión de células del linaje monocitos-macrófagos en preodontoclastos y aumenta la actividad de resorción radicular.3 En nuestro estudio, la El número de células RANKL+ no senescentes (p21–) y de células RANKL+ senescentes (p21+) no difirió hasta el día 5 de estrés, pero observamos diferencias notables desde el día 7 de estrés (Figs. 6d, 7d). Estos resultados sugieren que las células RANKL+ no senescentes y RANKL+ senescentes contribuyen al inicio de la odontoclastogénesis. Sin embargo, este último posiblemente desempeñe un papel esencial en el agravamiento o maduración de esta formación. De hecho, eliminamos la mayoría de los odontoclastos de TRAP y catepsina K + eliminando las células senescentes utilizando senolíticos (D + Q) (Figs. 9d, f y S6).

La administración de D + Q redujo significativamente la cantidad de células RANKL+, p21+ y/o p16+, lo que llevó a la inhibición de la resorción de la raíz (Fig. 9a-f). Se sabe que dasatinib inhibe la expresión de RANKL en las células del estroma de la médula ósea63 y la formación de osteoclastos;64,65 el fármaco podría inhibir directamente la expresión de RANKL de los cementoblastos senescentes y la formación de PDL y odontoclastos de los preodontoclastos. Mientras tanto, estudios previos han demostrado que la estimulación mecánica promueve que las células secreten ROS66 y citoquinas inflamatorias.67 Esos factores paracrinos pueden causar daño al ADN e inducir senescencia celular.68 Además, las células del linaje monocitos-macrófagos expuestas a ROS exógenos activan la cascada de señalización RANKL. lo que lleva a la formación de osteoclastos.69 Por el contrario, la quercetina, un componente de D + Q, tiene efectos antioxidantes y antiinflamatorios.38 Por lo tanto, el tratamiento con D + Q puede suprimir las células no senescentes para producir sustancias inflamatorias o ROS, que pueden prevenir la inducción de células senescentes y activación de la señalización de RANKL sin provocar muerte celular. Sin embargo, administramos D + Q en los días 1 y 7 de estrés, y el número total de células CAP+ en los tejidos periapicales también disminuyó en el día 14 de estrés (Fig. 9c); Las células TUNEL+ aumentaron el día 8 (Fig. S4). Por lo tanto, suponemos que D + Q tenía varias funciones: perjudicar la inducción de la senescencia celular en la fase temprana, causar la muerte celular de las células senescentes RANKL+ e impedir la formación de odontoclastos a partir de preodontoclastos, lo que previene la reabsorción radicular en la fase tardía.

Estudios anteriores han informado que la estimulación de RANKL causa la expresión de p21 durante la formación de osteoclastos.70 Por lo tanto, no podemos concluir si los odontoclastos experimentan senescencia celular solo a partir de la expresión de p21. Sin embargo, en este estudio, encontramos un número limitado de células multinucleares de catepsina K + p21 + p16 + en la fosa de resorción de la raíz (Fig. 8), lo que sugiere que los odontoclastos senescentes existen bajo estimulación de estrés mecánico. Aunque actualmente se desconocen las diferencias funcionales entre las células senescentes similares a los odontoclastos y otros odontoclastos, algunos casos de reabsorción de la raíz apical no se han recuperado durante 25 años.71 Dadas las características de las células senescentes que eluden la apoptosis, los odontoclastos senescentes pueden sobrevivir a largo plazo y contribuyen a la gravedad de la reabsorción radicular.

En este estudio, demostramos que las células senescentes inducidas por estrés mecánico inducidas por OTM contribuyeron a la resorción radicular. Sin embargo, son indispensables exámenes más detallados para explorar los mecanismos subyacentes a las relaciones entre las células senescentes, la odontoclastogénesis y la resorción radicular. Por ejemplo, existe una discrepancia entre el número de células senescentes RANKL+ y los odontoclastos durante la resorción radicular (otras células, moléculas, etc., pueden contribuir a la formación de odontoclastos). La asociación a largo plazo de las células senescentes con la resorción radicular aún no está clara. Además, debemos comparar con cautela los resultados en humanos y ratas. Otras condiciones, como distintos intervalos de administración, duraciones y concentraciones, provocarían resultados diferentes. Es esencial realizar más exámenes para verificar qué agentes senolíticos son aplicables para uso clínico para evitar efectos secundarios. Es importante destacar que, aunque nuestro estudio no pudo dilucidar los mecanismos moleculares detallados entre la expresión de RANKL y la formación de odontoclastos inducida por la senescencia celular bajo estrés mecánico utilizando ensayos in vitro, esos datos reforzarían la asociación de las células senescentes con la formación de odontoclastos. Los mecanismos deberían dilucidarse en detalle. Sin embargo, hasta donde sabemos, este es el primer estudio que demuestra que los cementoblastos senescentes inducidos por estrés mecánico o las células PDL desempeñan un papel crucial en los mecanismos de resorción de las raíces in vivo; El senolítico representativo utilizado en este estudio evitó la odontoclastogénesis y la resorción radicular. Además, se reveló la distribución espaciotemporal de células senescentes y odontoclastos en los tejidos periapicales bajo el movimiento dental ortodóncico. Estos hallazgos pueden proporcionar nuevos conocimientos sobre el desarrollo de nuevos métodos de prevención y tratamiento para la reabsorción radicular, que ha sido una preocupación duradera para los médicos desde que comenzó el tratamiento de ortodoncia.

Primero, se dobló un alambre de acero inoxidable de 0,014 pulgadas (Ormco Corp. Brea, California, EE. UU.) con unos alicates de alambre ligero, como se muestra en las figuras 1a y b, que ilustran las formas inicial y activada, respectivamente. El diseño se basa en el motivo del bucle en L comúnmente utilizado en el tratamiento clínico de ortodoncia. Los criterios de diseño específicos fueron: (1) los bucles en L se hicieron con un paso vertical de 1 mm entre la línea distal del bucle y la línea mesial del bucle en la forma inicial, y (2) los bucles en L se activaron mediante empujando la línea distal hacia abajo hasta la misma altura que la línea mesial. La fuerza vertical durante la activación fue de 5 N. Para confirmar la consistencia del bucle en L, se midió una fuerza de prueba vertical en el estado activado para el bucle en L utilizado en el experimento con una máquina de prueba universal en el departamento de investigación de biomateriales de Osaka Dental. Universidad. El mismo experimentador repitió la medición tres veces para obtener una fuerza de prueba promedio de 5 N como modelo OTM.

El comité de ética local de la Universidad Dental de Osaka aprobó los experimentos con animales y se siguieron estrictamente las políticas pertinentes (número de aprobación: 22-02031). Para el grupo experimental se utilizaron ratas Sprague Dawley (machos, 15 semanas de edad) que pesaban entre 400 y 450 g para evitar la generación de células senescentes relacionadas con la edad que afectarían el experimento. Todas las ratas se compraron en SHIMIZU Laboratory Supplies (Kyoto, Japón). Los modelos OTM se instalaron como se muestra en las figuras 1a, b. Después de anestesia general utilizando una mezcla de tres agentes anestésicos (tartrato de butorfanol: 2,5 mg·kg-1, midazolam: 2 mg·kg-1, clorhidrato de medetomidina: 0,15 mg·kg-1), se colocó un asa en L en las ratas. ' izquierda M1 (Fig. 1b). Los alambres en las superficies oclusales del segundo y tercer molar se empujaron hacia abajo verticalmente durante la fijación, y se usó resina (Kuraray Noritake, Nigata, Japón) para fijar los alambres en la porción distal de las superficies oclusales M2 y M3. Luego, se activó el bucle en L y se aplicó una fuerza de 5 N a la superficie oclusal M1. Utilizamos 32 ratas, divididas de la siguiente manera (4 ratas por grupo; Fig. 1c): 1. Grupo sin tratamiento (Control): sacrificado después de 14 días; 2. Grupos experimentales: sacrificados los días 0, 3, 5, 7 y 14 después de la instalación del bucle L; 3. Grupos 8d+D + Q y 14d+D + Q: se administraron senolíticos D + Q los días 1 y 7 después de la instalación del asa L y se sacrificaron el día 8 o 14.

Para observar la morfología de OTM y la resorción radicular, se escanearon muestras de maxilar de rata mediante μ-CT (SkyScan 1275, Bruker Co., Billerica, MA, EE. UU.) con un voltaje de 85 kV, una corriente de 65 μA y una alta resolución. de 1944 × 1546. Los datos 3D se reconstruyeron utilizando el software SkyScan ™ CT Analyzer (versión 1.17.7.2) y Mimics (software 13.1 Materialise, Lovaina, Bélgica). Se dibujaron líneas de referencia a lo largo del lado bucal del molar izquierdo de las ratas en las cúspides mesial y distal (Fig. 1d). La distancia vertical desde la cúspide mesial de M1 hasta la línea de referencia se consideró OTM (Fig. 1d). Las mediciones se realizaron utilizando ImageJ (versión: 2.1.0, Institutos Nacionales de Salud de EE. UU., Bethesda, MD, EE. UU.). También se cuantificó la RMD media del ápice de la raíz mesial del maxilar izquierdo M1.72

Las muestras se fijaron en formalina neutra al 10% durante 24 h. Después de la desmineralización en solución de desmineralización neutra B de ácido etilendiaminotetraacético (es decir, EDTA) (n.º de catálogo LEP2494; Fujifilm Wako Pure Chemicals Corporation) a 4 °C durante 2 semanas, los dientes se deshidrataron en un gradiente de sacarosa. Las secciones congeladas de todas las muestras se prepararon utilizando el método de Kawamoto.73 Se obtuvieron secciones congeladas en serie de 10 µm de espesor utilizando un criotomo (Leica CM3050S; Leica Biosystems, Richmond, IL, EE. UU.). La tinción HE de las secciones desmineralizadas se realizó mediante procedimientos estándar siguiendo un método informado previamente.48 La tinción TRAP se realizó utilizando el kit de tinción (Cat. No. 294-67001; Fujifilm Wako Pure Chemicals Corporation) para confirmar los odontoclastos y los osteoblastos. Las imágenes se tomaron con un microscopio digital BZ-9000 (Keyence Corporation, Osaka, Japón).

Las secciones descalcificadas se revitalizaron con antígeno con solución de recuperación de antígeno HistoVT One al 10 % (n.º de catálogo 06380-76, Nacalai Tesque. Inc. Kyoto, Japón), luego se bloquearon y permeabilizaron en suero de cabra al 5 % y Triton X-100 al 0,3 % en fosfato. -solución salina tamponada, respectivamente. A continuación, las secciones se conjugaron con anticuerpos primarios: anticuerpo policlonal anti-p21 ALEXA FLUOR® 555 (n.º de catálogo: bs-10129R-A555, Bioss Antibodies Inc, Woburn, MA, EE. UU., 1:100), anticuerpo policlonal anti-p16 ALEXA FLUOR® 594 (N.º de catálogo: bs-23881R-A594, 1:100), anticuerpo policlonal anti-p16 Conjugado ALEXA FLUOR® 488 (N.º de catálogo: bs-23881R-A488, 1:100), anti- Conjugado RANKL ALEXA FLUOR® 647 (n.º de cat.: bs-20646R-A647, 1:100), conjugado anti-catepsina K ALEXA FLUOR® 647 (n.º de cat.: SC-48353 AF647, Santa Cruz Biotechnology. Inc, California , EE. UU., 1:100), y conjugado de proteína anti-fijación de cemento (3G9) ALEXA FLUOR® 488 (n.º de cat.: SC-53947 AF488, 1:100), conjugado anti-Ki67 ALEXA FLUOR® 488 (n.º de cat. .: 118825, Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, Massachusetts, EE. UU., 1:100). Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C y se montaron con DAPI-Fluoromount-G®. Luego, se observaron bajo un microscopio láser confocal (LSM-700, Zeiss-Microscopy, Jena, Alemania).

Todos los reactivos de tinción TUNEL anteriores se obtuvieron de los kits de ensayo CF™ Dye TUNEL ALEXA FLUOR® 647 (Cat. No. 30074, Fermont, CA, Biotium, Inc.). Todas las secciones se tiñeron según el protocolo del kit y se montaron con DAPI-Fluoromount-G®. Todas las secciones se observaron bajo un microscopio láser confocal (LSM-700, Zeiss-Microscopy, Jena, Alemania).

Los análisis cuantitativos de TRAP, tinción TUNEL y tinción por inmunofluorescencia se calcularon de la siguiente manera: la región de interés (ROI) en cada sección se analizó bajo un campo de visión de 10 × (tinción TRAP) o 20 × (TUNEL y tinción de inmunofluorescencia). Luego, se seleccionó una capa de células de cemento en la línea de demarcación del borde de la raíz como ROI de la superficie de la raíz por sección. El rango desde la capa externa de células en la línea de demarcación hasta la superficie del hueso alveolar se tomó como ROI del área PDL. Usamos ImageJ (versión: 2.1.0, Institutos Nacionales de Salud de EE. UU., Bethesda, MD, EE. UU.) para contar la cantidad de células TRAP positivas dentro del ROI y Fiji2 (versión: 1.0, Institutos Nacionales de Salud de EE. UU., Bethesda, MD, EE. UU.) para contar el número de células positivas para TUNEL y tinción múltiple de inmunofluorescencia positiva dentro del ROI. Probamos cuatro muestras de cuatro ratas (n = 4). Cada rata fue sometida a un experimento independiente.

La solución de PEG-200 se preparó disolviendo polietilenglicol 200 (PEG-200, n.º de catálogo: ESL3444, FUJIFILM Wako Pure Chemical Co., Osaka, Japón) en MillQ. Se disolvieron dasatinib (n.º de cat.: 11498, Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI, EE. UU.) y quercetina (n.º de cat.: sc-206089A, SCB Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, EE. UU.) en el solución de PEG-200 preparada anteriormente y se mezcló bien para hacer senolíticos. A cada rata del grupo post-estrés se le administraron por vía oral senolíticos a 6,67 mg·kg-1 (D) y 66,7 mg·kg-1 (Q) los días 1 y 7 después de la instalación del asa L, respectivamente.

Todos los datos se analizaron estadísticamente utilizando Prism 8 (GraphPad Software Co., San Diego, CA, EE. UU.). Todos los resultados se presentaron como medias ± desviaciones estándar. Se utilizó la prueba t de Student para las comparaciones entre dos grupos. Se realizó un análisis de varianza unidireccional seguido de la prueba posterior de comparación múltiple de Tukey para las comparaciones entre cinco grupos. Un valor de P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Todos los datos asociados con este estudio se presentan en el artículo.

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Agradecemos a Ye Zhang, Yuzhu Sun (Departamento de Biomateriales, Universidad Dental de Osaka), Jianxin Zhao, Yoshitsugu Nakamoto, Yosuke Miyaji, Hiroshi Matoba (Departamento de Ortodoncia, Universidad Dental de Osaka) por asesorar los experimentos con animales y a Keita Yoshida (Departamento de Anestesiología). , Universidad Dental de Osaka) y Yuya Hirai (Departamento de Biología, Universidad Dental de Osaka) por su apoyo en la tinción de inmunofluorescencia. Este trabajo fue apoyado por JST, CREST Grant Number JPMJCR22L5, Japón.

Departamento de Ortodoncia, Universidad Dental de Osaka, 8-1 Kuzuhahanazonocho, Hirakata, Osaka, Japón

Yue Zhou, Aki Nishiura, Hidetoshi Morikuni, Wenqi Deng y Naoyuki Matsumoto

Departamento de Física, Universidad Dental de Osaka, 8-1 Kuzuhahanazonocho, Hirakata, Osaka, Japón

Toru Tsujibayashi

Departamento de Anestesiología, Universidad Dental de Osaka, 8-1 Kuzuhahanazonocho, Hirakata, Osaka, Japón

Yoshihiro Momota

Departamento de Farmacología, Facultad de Odontología de la Universidad de Showa, 1-5-8 Hatanodai, Shinagawaku, Tokio, Japón

Yuki Azetsu y Masamichi Takami

Departamento de Anatomía Oral, Universidad Dental de Osaka, 8-1 Kuzuhahanazonocho, Hirakata, Osaka, Japón

Yoshitomo Honda

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AN, YH e YZ concibieron y diseñaron la investigación. YZ, WD y AN realizaron el experimento. YZ, AN, YA, MT y YH analizaron los datos. YH, YZ y AN escribieron el borrador y el manuscrito. Documento revisado de HM, TT, YM, YA, MT y NM. AN y YH supervisaron la investigación. Todos los autores aprobaron la versión final del artículo.

Correspondencia a Aki Nishiura o Yoshitomo Honda.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Zhou, Y., Nishiura, A., Morikuni, H. et al. Células senescentes RANKL+ bajo estrés mecánico: un objetivo terapéutico para la reabsorción radicular de ortodoncia utilizando senolíticos. Int J Oral Sci 15, 20 (2023). https://doi.org/10.1038/s41368-023-00228-1

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Recibido: 15 de octubre de 2022

Revisado: 29 de abril de 2023

Aceptado: 04 de mayo de 2023

Publicado: 30 de mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41368-023-00228-1

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